新型高倍二肽甜味劑的制備與表征

穆小青 晏日安 譚奇坤 胡 晶 周 華

(暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632)

阿斯巴甜是由James Schlatter于1965年在研究一種四肽促胃液分泌激素的過程中偶然發(fā)現(xiàn)得到的[1]。作為第一代二肽甜味劑，阿斯巴甜具有口感好、熱量低、易制備等優(yōu)點。但由于在一定使用條件下阿斯巴甜的穩(wěn)定性較差，且分解后產(chǎn)生苯丙氨酸，苯丙酮尿癥患者不宜食用，因而限制了其使用范圍[2]。為了提高二肽甜味劑的穩(wěn)定性和甜度，使其更適于消費者生理需求和食品加工要求，研究者們對阿斯巴甜的苯丙氨酸或天冬氨酸進行了結構修飾，得到的二肽甜味劑有良好的穩(wěn)定性。目前關于阿斯巴甜衍生物的研究較為廣泛，已經(jīng)合成阿力甜[3]、紐甜[4]、愛德萬甜[5]等多種二肽甜味劑。其中，應用最多的是紐甜(圖1)，化學名為N-[N-(3，3-二甲基丁基)-L-α-天冬氨酰]-1-甲酯，其甜度約為蔗糖的8 000倍，攝入人體后不會被分解為單個氨基酸，苯丙酮尿癥患者亦可服用，已經(jīng)被批準作為食品添加劑廣泛應用于食品加工行業(yè)[4]。

圖1 紐甜及紐甜類似物結構

紐甜類似物是一類以天冬氨酸和苯丙氨酸為二肽母體，由各種取代基的苯丙醛與阿斯巴甜反應制得的二肽甜味劑。較阿斯巴甜，紐甜類似物有更好的穩(wěn)定性和甜度。研究[6-8]表明，在紐甜類似物基團R上引入各種3-苯基丙基取代基可獲得比阿斯巴甜更甜的甜味劑，且甜度強弱與基團R上的甲基數(shù)有關。但目前大多數(shù)紐甜類似物制備時，合成各種取代基的苯丙醛條件苛刻，操作復雜且產(chǎn)率低，不能很好地應用于食品工業(yè)中。因而，很多學者將目光集中在優(yōu)化各種取代基的苯丙醛的制備方法上，以期得到更優(yōu)良的甜味劑和更簡易的反應條件。目前二肽甜味劑的合成中，制備各種取代基的苯丙醛主要方法有Grignard reaction(格氏反應)和Friedel-Crafts(傅克烷基化)反應。由于反應條件復雜，且伴隨許多副反應的發(fā)生，因而大大降低了反應產(chǎn)率和經(jīng)濟效益，限制了這些甜味劑在工業(yè)生產(chǎn)上的應用[9-12]。因此，增加紐甜類似物基團R的碳鏈長度，合成有關取代基的苯丙醛，是近些年研究者們想攻克的重點和難點。

為在紐甜類似物基團R上引入各種3-苯基丙基取代基，試驗擬設計以苯硼酸與不飽和烯酸為原料通過Heck(赫克)反應得到苯丙酸類似物，繼而得到苯丙醛類似物及二肽甜味劑的合成路線。Heck反應中，催化劑Pd(OAc)2/bpy(醋酸鈀/聯(lián)吡啶)性質(zhì)穩(wěn)定，在有氧和高濕環(huán)境下的催化效率都很高，反應產(chǎn)率也高，能克服傳統(tǒng)Grignard reaction和Friedel-Crafts反應條件復雜，副產(chǎn)物多的缺點[13-15]。同時，試驗還對溶劑濃度、催化劑用量、反應溫度、反應時間對該反應的影響進行考察，以期篩選出最優(yōu)反應條件。

1 材料與方法

1.1 儀器

磁力攪拌器：MS-H-Pro型，美國賽洛捷克公司；

旋轉蒸發(fā)器：N-1300V-WB型，東京理化器械株式會社；

低溫反應儀：PSL-1820型，東京理化器械株式會社；

電子天平：AL204型，瑞士梅特勒—托利多公司；

控溫型顯微熔點測定儀：X-5型，北京泰克儀器有限公司；

紅外光譜儀：is50 FT-IR型，美國Thermo公司；

電子轟擊電離質(zhì)譜儀：QTRAP4500型，美國Thermo公司；

核磁共振波譜儀：AVANCE Ⅲ型，瑞士布魯克公司。

1.2 樣品與試劑

3，4-亞甲基苯硼酸(99%)、3，3-二甲基丙烯酸(99%)、丙酮、醋酸鈀、聯(lián)吡啶、氯化亞砜、二異丁基氫化鋁、鈀/碳：分析純，薩恩化學技術(上海)有限公司；

N-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯：分析純，廣州市光華科技股份有限公司；

氘代-甲醇、氘代-氯仿：99.8%，Cambridge Isotope Laboratories。

1.3 試驗方法

1.3.1 合成路線 如圖2所示，先經(jīng)過Heck加成反應、酯化反應、DIBAL-H合成中間體3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁醛，后利用3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁醛和阿斯巴甜通過催化加氫合成終產(chǎn)物N-{N-[3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基]-α-L-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸甲酯。

(1)3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸(5)的合成：向100 mL圓底燒瓶中依次加入3，4-亞甲基苯硼酸(1.327 g，8 mmol)、丙酮水溶液(V丙/V水=5∶1，24 mL)、3,3-二甲基丙烯酸(0.400 g，4 mmol)、醋酸鈀(0.054 g，0.24 mmol)、聯(lián)吡啶(0.062 g，0.4 mmol)，加熱至70 ℃并冷凝回流，磁力攪拌36 h后，薄層層析監(jiān)測(TLC)。反應結束后冷卻至室溫，硅藻土過濾除去醋酸鈀，然后用二氯甲烷洗滌濾渣，并用二氯甲烷(80 mL×3)萃取有機層，水(65 mL)洗滌有機層，最后用無水硫酸鈉干燥、過濾，減壓除去溶劑，柱層析純化(石油醚∶乙酸乙酯=300∶10～300∶13)，得到白色固體產(chǎn)物3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸[15](0.792 5 g，3.6 mmol)，產(chǎn)率90%。

圖2 N-{N-[3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基]-α-L-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸甲酯的合成路線

(2)3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸甲酯(6)的合成：向150 mL圓底燒瓶中依次加入3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸(1.121 g，5 mmol)、無水甲醇(50 mL)，于0 ℃下攪拌反應，向反應瓶中緩慢滴加氯化亞砜(2.5 mL)，室溫下磁力攪拌4 h，TLC監(jiān)測(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1，Rf=0.5，堿性高錳酸鉀顯色)。反應結束后，減壓除去溶劑，柱層析進一步純化(石油醚∶乙酸乙酯=300∶3～300∶4)，得到無色透明液體3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸甲酯[16](1.156 g，4.7 mmol)，產(chǎn)率97%。

(3)3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁醛(7)的合成：向100 mL底燒瓶中依次加入3-甲基-3-(3,4-亞甲二氧基苯基)丁酸甲酯(236.27 mg，1 mmol)、無水二氯甲烷(20 mL)，反應置于-78 ℃下攪拌。在氮氣保護下，向反應瓶中緩慢滴加二異丁基氫化鋁(DIBAL-H，1.0 mol/L in THF，1.2 mL，1.2 mmol)，-78 ℃下攪拌反應1 h，TLC監(jiān)測(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1，Rf=0.4，茴香醛顯色)。反應結束后，向反應液中加入飽和氯化銨溶液(20 mL)以淬滅反應，攪拌至室溫。攪拌結束后，用二氯甲烷(20 mL×3)萃取有機相，飽和食鹽水(20 mL)洗滌有機相，無水硫酸鈉干燥、過濾，最后減壓除去溶劑，柱層析進一步純化(石油醚∶乙酸乙酯=150∶3)，得到無色透明液體[17](189.72 mg，0.92 mmol)，產(chǎn)率92%。

(4)N-{N-[3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基]-α-L-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸甲酯(9)的合成：向50 mL圓底燒瓶中依次加入3-甲基-3-(3,4-亞甲二氧基苯基)丁醛(206.24 mg，1 mmol)，體積分數(shù)為80%的甲醇(10 mL)，N-α-L-天冬氨酞-L-苯丙氨酸-1-甲酯(294.20 mg，1 mmol)，攪拌5 min。然后在氮氣保護下，向反應液中加入10%鈀碳(80 mg)，常溫常壓氫氣條件下反應24 h。TLC監(jiān)測(二氯甲烷∶甲醇∶乙酸=2.0∶1.0∶0.1，Rf=0.2，茚三酮顯色)。反應結束后，硅藻土過濾除去鈀碳，然后用二氯甲烷洗滌濾渣，減壓除去溶劑，柱層析進一步純化(石油醚∶乙酸乙酯∶乙酸=200∶25∶2)，得到白色固體產(chǎn)物[18-19](348.9 mg，0.72 mmol)，產(chǎn)率72%，熔程82～84 ℃。

1.3.2 反應條件的優(yōu)化 以3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸(5)的產(chǎn)率為指標，分別選取3，4-亞甲基苯硼酸與3，3-二甲基丙烯酸摩爾比2∶1，丙酮溶液體積濃度為80%，Pd(OAc)2摩爾分數(shù)5%，反應溫度60 ℃，反應時間48 h。固定其他影響因素，分別考察溶劑濃度為70%，80%，90%，100%，催化劑摩爾分數(shù)為3%，4%，5%，6%，7%，反應溫度為50，60，70，80，90 ℃，反應時間為24，36，48，60，72 h時3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸(5)的產(chǎn)率變化，確定最適反應條件。

1.3.3 產(chǎn)物甜度的感官測定 根據(jù)文獻[20]修改如下：

(1)對照甜味劑溶液的配制：在25 ℃下，稱取1 g蔗糖加蒸餾水稀釋至10 mL，即為100 g/L的蔗糖溶液，依次配制100，200，300，…，900，1 000 g/L的蔗糖溶液。

指的是學生針對特定的學生習作進行討論修改的一種方式。運用這一教學指導策略，教師可建議學生在寫作訓練遇到難以獨立解決的困難時主動與同學討論解決策略，得出結論之后再對文章進行潤色。應用這一策略，教師應事先對學生進行小組劃分，以便于學生進行討論修改，并且引導學生在討論習作問題的時候從評判標準出發(fā)。

在25 ℃下，稱取1 g阿斯巴甜加蒸餾水稀釋至1 L，即為1 g/L的阿斯巴甜溶液，依次配制1，2，3，…，9，10 g/L的阿斯巴甜溶液。

(2)待測甜味劑溶液的配制：在25 ℃下，稱取10 mg樣品加蒸餾水稀釋至1 L，即為10 mg/L的樣品溶液。依次配制10，20，30，…，90，100 mg/L的樣品溶液。

(3)相對甜度測定：待測甜味劑的甜度為相對甜度，采用感官品嘗的方式來測定，評定小組由10人(男女比例1∶1)組成，分別進行品嘗。品嘗待測甜味劑溶液前，用純凈水漱口，間隔15 min后再品嘗下一個待測樣品。判斷系列濃度樣品中與對照組溶液的甜度相同或相近的甜味劑濃度，按式(1)計算樣品的相對甜度。

(1)

式中：

s——相對甜度，%；

c1——對照甜味劑濃度，mg/L；

c2——等甜度樣品濃度，mg/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

化合物結構的繪制及結構分析、化學反應路線分析，ChemBioOffice 2014；化合物1H NMR、13C NMR譜圖的分析，結構的確定MestReNova 12.0；IR譜圖的分析，OMNIC8.2；MS譜圖的分析，SCIEX OS1.4；反應條件、甜度分析，Microsoft Excel 365。

2 結果與討論

2.1 產(chǎn)物結構表征

2.1.1 3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸(5)結構的鑒定

(1)1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ6.85(d，J=1.9 Hz，1H)，6.79(dd，J=8.2，2.0 Hz，1H)，6.72(d，J=8.2 Hz，1H)，5.91(s，2H)，2.58(s，2H)，1.40(s，6H)。

(2)13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ177.98，148.20，146.24，142.75，119.01，108.45，107.10，101.56，78.10，77.68，77.26，48.82，37.59，29.80。

(3)IR(KBr)νmax3 437，3 070，2 977，2 913，2 681，2 603，1 818，1 694，1 599，1 504，1 429，1 412，1 373，1 320，1 254，1 229，1 186，1 119，1 036，937，904 cm-1。

(4)HRMS(ESI+)m/zC12H14O4，223.096 6；(ESI-)m/zC12H14O4，221.081 4。

2.1.2 3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸甲酯(6)結構的鑒定

(1)1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ6.87(d，J=1.9 Hz，1H)，6.80(dd，J=8.2，1.9 Hz，1H)，6.73(d，J=8.2 Hz，1H)，5.92(s，2H)，3.55(s，3H)，2.57(s，2H)，1.41(s，6H)。

(2)13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ172.62，148.16，146.16，143.00，119.00，108.40，107.12，101.54，78.14，77.72，77.29，51.88，48.99，37.71，29.80。

(3)IR(KBr)νmax3 349，2 952，2 835，1 730，1 488，1 432，1 345，1 235，1 112，1 024，934，906，858，808，725，640 cm-1。

(4)MS(ESI，+ve)m/z237.1[(M+H)+]；259.1[(M+Na)+]。

2.1.3 3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁醛(7)結構的鑒定

(1)1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ9.50(t，J=3.0 Hz，1H)，6.88(d，J=1.9 Hz，1H)，6.81(dd，J=8.2，2.0 Hz，1H)，6.77(d，J=8.2 Hz，1H)，5.94(s，2H)，2.62(d，J=3.0 Hz，2H)，1.42(s，6H)。

(2)13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ 203.37，148.25，146.18，141.82，118.81，108.37，106.80，101.37，57.03，37.03，30.03。

(3)IR(KBr)νmax2 964，2 737，1 716，1 611，1 487，1 431，1 341，1 231，1 111，1 036，934，859，810，727，641 cm-1。

(4)GC-MS(EI)m/z206.1。

2.1.4N-{N-[3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基]-α-L-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸甲酯(9)結構的鑒定

(1)1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ8.53(s，1H)，7.23(t，J=7.1 Hz，2H)，7.19(t，J=7.4 Hz，1H)，7.17～7.11(m，2H)，6.80(s，1H)，6.70(s，2H)，5.85(s，2H)，4.72(td，J=8.1，5.4 Hz，1H)，3.91(s，1H)，3.65(s，3H)，3.13(dd，J=13.9，5.4 Hz，1H)，2.97(dd，J=13.9，8.5 Hz，1H)，2.59(d，J=33.5 Hz，4H)，1.98(s，2H)，1.22(d，J=2.8 Hz，6H)。

(2)13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ175.23，171.76，168.84，148.14，145.99，141.77，136.62，129.54，128.84，127.36，118.81，108.29，106.82，101.25，58.78，54.32，52.73，44.01，41.20，37.90，37.07，30.06，29.72，29.46。

(3)IR(KBr)νmax2 956，1 799，1 739，1 686，1 550，1 503，1 489，1 433，1 344，1 233，1 113，1 039，985，911，814，730，702，645 cm-1。

(4)HRMS(ESI+)m/zC26H32N2O7，485.227 3。

根據(jù)NMR的分析方法對終產(chǎn)物N-{N-[3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基]-α-L-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸甲酯進行1H NMR和13C NMR分析，其NMR譜圖如圖3所示。由1H NMR可知，δ8.53(s，1H)為終產(chǎn)物肽鍵氨基上的1個氫；7.23(t，J=7.1 Hz，2H)，7.19(t，J=7.4 Hz，1H)，6.70(s，2H)分別為苯丙氨酰甲酯苯環(huán)上的5個氫；7.17～7.11(m，2H)，6.80(s，1H)為3，4-亞甲二氧基苯基苯環(huán)上的3個氫；5.85(s，2H)為3，4-亞甲二氧基中間碳上面的2個氫；4.72(td，J=8.1，5.4 Hz，1H)為L-苯丙氨酰甲酯叔碳上的1個氫；3.91(s，1H)為L-天冬氨酰叔碳上的1個氫；3.65(s，3H)為L-苯丙氨酰甲酯伯碳上的3個氫；3.13(dd，J=13.9，5.4 Hz，1H)，2.97(dd，J=13.9，8.5 Hz，1H)為L-苯丙氨酰甲酯仲碳上的2個氫；2.59(d，J=33.5 Hz，4H)是L-天冬氨酰仲碳的2個氫和3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基上靠近氮的仲碳上的2個氫；1.98(s，2H)為3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基上靠近苯環(huán)的仲碳上的2個氫；1.22(d，J=2.8 Hz，6H)為3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基上2個甲基上的6個氫。

圖3 化合物9的1H NMR和13C NMR譜圖

由13C NMR譜可知，δ175.23，171.76，168.84為3個羰基上的碳；148.14，145.99，141.77，136.62，129.54，128.84，127.36，118.81，108.29，106.82為2個苯環(huán)上的碳；101.25為3，4-亞甲二氧基苯基上的仲碳；58.78為L-天冬氨酰上的叔碳；54.32為L-苯丙氨酰甲酯上的叔碳；52.73為L-苯丙氨酰甲酯上的伯碳；44.01為3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基上靠近苯環(huán)的仲碳；41.20為3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基上靠近氮的仲碳；37.90，37.07分別為L-天冬氨酰和L-苯丙氨酰甲酯的仲碳；30.06，29.72，29.46分別為3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基上的季碳和2個伯碳。

由IR圖譜數(shù)據(jù)可知，與阿斯巴甜相比，終產(chǎn)物在1 233 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰且強度很強，為C—O鍵伸縮振動的特征吸收峰。結合NMR、IR和HRMS，可以確定3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁醛與阿斯巴甜發(fā)生了還原氨化反應，其產(chǎn)物為N-{N-[3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基]-α-L-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸甲酯。

2.2 反應條件的優(yōu)化與篩選

上述1.3.2及1.3.3的方法進行單因素試驗，結果如圖4 所示。

由圖4(a)可知，當溶劑體積濃度為80%時，結果與文獻[15]報道的一致，3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸的產(chǎn)率最高，可能是因為80%的丙酮溶液能夠為Heck反應提供良好的反應環(huán)境。溶劑濃度過低，水分過多，對反應物有稀釋作用，不利于反應的發(fā)生；濃度過高，水提供的質(zhì)子太少，降低了反應效率。由圖4(b)可知，隨著催化劑Pd(OAc)2添加量的增加，產(chǎn)物出現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢，可能是因為隨著催化劑的增加，反應速率增大，隨后催化劑達到飽和，催化速率趨于平衡，產(chǎn)物得率趨于平穩(wěn)。如圖4(c)所示，隨著反應溫度的升高，產(chǎn)率呈現(xiàn)先逐漸增加后降低的趨勢，可能是因為隨著溫度的升高，Pd(OAc)2的催化活性逐漸提高，達到一定溫度后，過高的溫度會使催化劑活性降低，產(chǎn)率隨之降低。隨著反應時間的延長，產(chǎn)物得率先增加后降低，當反應時間為72 h時，反應產(chǎn)率急劇降低，可能是因為隨著時間的延長，副反應增加，且催化劑的耗能增加，抑制了Heck反應的發(fā)生。

2.3 產(chǎn)物甜度

通過試驗小組的感官評價得到數(shù)據(jù)，將各個濃度代入式(1)即可得到待測樣品的相對甜度。以待測樣品溶液濃度為橫坐標，等甜度的蔗糖溶液、阿斯巴甜濃度為縱坐標，分別制得關系曲線，如圖5所示。

由圖5可知，N-{N-[3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基]-α-L-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸甲酯的甜度約為蔗糖的3萬倍，阿斯巴甜的150倍，與專利[7]中報道的甜度一致。其甜味出現(xiàn)較蔗糖要緩慢，有一定的滯后性，但持續(xù)時間較長，甜味純正，無糖精鈉、AK糖等甜味劑的苦澀感和金屬味。

3 結論

以3，4-亞甲基苯硼酸、3，3-二甲基丙烯酸為原料，通過Heck反應、酯化反應、DIBAL-H還原及氫氣還原氨化4步反應，成功合成了二肽甜味劑N-{N-[3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基]-α-L-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸甲酯。用NMR、IR、HRMS等技術對中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物進行結構分析，研究發(fā)現(xiàn)中間產(chǎn)物3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸甲酯為新化合物，終產(chǎn)物N-{N-[3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁基]-α-L-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸甲酯的結構確證無誤。經(jīng)感官評價，驗證其甜度約為蔗糖的3萬倍。

圖4 不同因素對3-甲基-3-(3，4-亞甲二氧基苯基)丁酸產(chǎn)率的影響

圖5 蔗糖和阿斯巴甜質(zhì)量濃度與產(chǎn)物質(zhì)量濃度的關系

試驗合成醛類的路線突破了以往難以在紐甜類似物的N-端引入苯丙基衍生基團的難點，為拓展二肽甜味劑的多樣性提供了新思路。此外，試驗所用原料經(jīng)濟易得，反應條件易控制，操作簡單且產(chǎn)率較高，為合成高倍甜味劑提供了一種高效的方法。