基于PLO基因的山羊化膿隱秘桿菌PCR檢測方法的建立與應用

沈克飛，楊 柳，付利芝，徐登峰，許國洋，張素輝

(1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460; 2.重慶市獸用生物制品工程技術研究中心，重慶 402460)

化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes)是革蘭氏陽性短棒狀桿菌，是牛、羊和豬等重要經(jīng)濟動物的條件性致病菌，常寄生于上呼吸道和消化道黏膜，可引起多種器官和黏膜發(fā)生化膿性感染，多數(shù)情況下感染造成慢性消耗性疾病[1-4]。從白尾鹿[5]、狍[6]腦膿腫中也分離到致病性化膿隱秘桿菌。該菌常與其他病原菌混合感染[7]。這些病原菌致病性及耐藥性存在差異，給疫病防治帶來困難。急需解決的問題是如何進行化膿性感染病原體的快速鑒別，這對疾病防治有重要意義。

化膿隱秘桿菌不易培養(yǎng)且生長緩慢，傳統(tǒng)病原菌分離鑒定方法費時，且易出現(xiàn)漏檢，不能達到快速診斷的目的。現(xiàn)有的化膿隱秘桿菌快速鑒別方法是分子檢測方法，主要靶基因是PLO(Pyolysin)基因[8]。重慶市畜牧科學院獸醫(yī)獸藥研究所(本所)在檢測山羊化膿性樣本過程中發(fā)現(xiàn)，基于化膿隱秘桿菌PLO基因建立的PCR檢測方法最易與偽結(jié)核棒狀桿菌發(fā)生交叉反應。為此，本研究基于PLO基因建立常規(guī)PCR檢測方法，并進行特異性和敏感性評價，為化膿隱秘桿菌的快速鑒別提供一種可靠方法。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品

化膿隱秘桿菌、偽結(jié)核棒狀桿菌、葡萄球菌、奇異變形桿菌、類芽孢桿菌、釀膿鏈球菌、明串球菌、腸球菌、大腸桿菌、腸球菌、溶血性曼氏桿菌、沙門氏菌等均由本所分離、鑒定及保存?；撾[秘桿菌感染的小鼠肺臟組織、淋巴結(jié)組織、膿液由本所攻毒、鑒定及保存。

1.2 試 劑

TSB或TSA培養(yǎng)基購自BD；PCR Mix、細菌DNA提取試劑盒、組織DNA提取試劑盒購自TaKaRa。

1.3 序列分析及引物設計

將化膿隱秘桿菌重慶分離株2012CQ-ZSH基因組(GenBank登錄號CP012649)中的PLO基因及其蛋白質(zhì)序列在NCBI上進行BLAST搜索，以進行同源性分析。根據(jù)此序列采用Primer-BLAST方法搜索引物，從候選引物中篩選4對，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.4 DNA模板的制備

用TSB或TSA培養(yǎng)化膿隱秘桿菌，收獲培養(yǎng)物，使用細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA。取小鼠肺臟組織、淋巴結(jié)組織、膿液樣本，使用組織DNA提取試劑盒提取DNA。

1.5 PCR擴增

將上述提取的DNA模板用上述引物進行PCR擴增，陰性對照為超純水，PCR反應體系為20 μL，反應體系見表2。PCR反應參數(shù)為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，30個循環(huán)；72 ℃ 3 min；室溫保存。

表1 引物信息Table 1 Primer Information

表2 PCR反應體系Table 2 PCR reaction system

1.6 特異性分析

培養(yǎng)偽結(jié)核棒狀桿菌、葡萄球菌、奇異變形桿菌、類芽孢桿菌、釀膿鏈球菌、明串球菌、腸球菌、大腸桿菌、腸球菌、溶血性曼氏桿菌、沙門氏菌等細菌。使用細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA。以此為模板，按上述反應體系和反應參數(shù)進行PCR擴增以驗證PCR方法的特異性。

1.7 敏感性分析

使用細菌DNA提取試劑盒提取新鮮培養(yǎng)的化膿隱秘桿菌DNA，測定核酸質(zhì)量，調(diào)整質(zhì)量濃度為1 000 ng/μL，依次稀釋成100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、1×10-1ng/μL、1×10-2ng/μL、1×10-3ng/μL、1×10-4ng/μL、1×10-5ng/μL和1×10-6ng/μL。以上述10個稀釋度的DNA溶液為模板進行PCR擴增。同時按上述方法稀釋小鼠肺臟組織、淋巴結(jié)組織、膿液樣本的DNA，測試PCR方法的敏感性。

1.8 臨床樣本檢測

使用組織DNA提取試劑盒提取臨床樣本，樣本包括患化膿性感染疾病的山羊淋巴結(jié)(157份)、肺臟(186份)、膿液(97份)等。反應體系見表3，按“1.5”中反應參數(shù)進行PCR擴增，陰性對照為偽結(jié)核棒狀桿菌DNA。

表3 化膿隱秘桿菌檢測PCR反應體系Table 3 PCR reaction system of detecting T.pyogenes

1.9 PCR產(chǎn)物檢測及結(jié)果分析

取5 μL PCR擴增產(chǎn)物用12 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測?；厥贞栃詶l帶，將其克隆至pMD18-T，轉(zhuǎn)化至DH5α，挑選陽性克隆對其中的插入片段進行序列測定，在NCBI進行BLST搜索以進行同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

PLO基因在化膿隱秘桿菌不同分離株中相對保守，同源性高于96%，與其他細菌無同源性。PLO蛋白質(zhì)在化膿隱秘桿菌不同分離株中的同源性高于98%，與其他細菌的同源性低于67%。所有引物與化膿隱秘桿菌核苷酸序列的覆蓋率和同源性最高，均為100%；與其他細菌核苷酸序列的覆蓋率低于95%。

2.2 PCR結(jié)果及其產(chǎn)物分析

4對引物均能從化膿隱秘桿菌培養(yǎng)物、確診含有化膿隱秘桿菌的小鼠肺臟組織、淋巴結(jié)組織和膿液中特異性擴增出與預期大小相符的目的條帶(圖1)。序列測定和序列分析結(jié)果顯示，所得序列與化膿隱秘桿菌PLO基因的同源性高于92%，與其他細菌無同源性，表明所擴增片段是化膿隱秘桿菌PLO基因。

2.3 F1/R1-PCR特異性

只有F1/R1引物對能從化膿隱秘桿菌DNA模板中擴增出特異條帶，而未從偽結(jié)核棒狀桿菌、葡萄球菌、奇異變形桿菌、類芽孢桿菌、釀膿鏈球菌、明串球菌、腸球菌、大腸桿菌、腸球菌、溶血性曼氏桿菌、沙門氏菌等細菌DNA中擴增出條帶，表明F1/R1引物對能準確檢測化膿隱秘桿菌，且區(qū)分其他細菌(圖1)。

2.4 F1/R1-PCR敏感性

由圖2可知，以化膿隱秘桿菌純培養(yǎng)物DNA為模板，DNA質(zhì)量濃度為1×10-3ng/μL 時能出現(xiàn)清晰可見的目的條帶，質(zhì)量濃度小于1×10-3ng/μL 時無明顯條帶出現(xiàn)。由此可見，F(xiàn)1/R1-PCR準確檢測化膿隱秘桿菌的最低模板質(zhì)量濃度為1×10-3ng/μL。以小鼠肺臟組織、淋巴結(jié)組織、膿液樣本的DNA為模板，F(xiàn)1/R1-PCR能擴增出清晰條帶的DNA質(zhì)量濃度為1×10-2ng/μL。

A.F1/R1引物對 Primer pair F1/R1; B.F2/R2引物對 Primer pair F2/R2; C.F3/R3引物對 Primer pair F3/R3; D.F4/R4引物對 Primer pair F4/R4; M.DNA marker DL2000；1.化膿隱秘桿菌固體培養(yǎng)物T.pyogenescultured in solid medium；2.化膿隱秘桿菌液體培養(yǎng)物T.pyogenescultured in liquid medium；3.肺臟組織 Lung；4.淋巴結(jié)組織 Lymph gland；5.膿液 Pus；6.陽性對照 Positive control；7.偽結(jié)核棒狀桿菌Corynebacteriumpseudotuberculosis；8.葡萄球菌Staphylococcus；9.奇異變形桿菌Proteusmirabilis；10.類芽孢桿菌Paenibacillus；11.釀膿鏈球菌Streptococcuspyogenes；12.明串球菌Leuconostocmesenteroides；13.大腸桿菌Escherichiacoli；14.腸球菌Enterococcus

圖1PCR檢測結(jié)果
Fig.1ResultsofPCRdetection

M.DNA marker DL2000；1.1 000 ng/μL；2.100 ng/μL；3.10 ng/μL；4.1 ng/μL；5.1×10-1ng/μL；6.1×10-2ng/μL；7.1×10-3ng/μL；8.1×10-4ng/μL；9.1×10-5ng/μL；10.1×10-6ng/μL ；11.陰性對照 Negative control

圖2F1/R1-PCR敏感性分析
Fig.2F1/R1-PCRsensitivityanalysis

2.5 臨床樣本檢測及其PCR產(chǎn)物分析

運用F1/R1-PCR方法能從患化膿性感染的山羊淋巴結(jié)(121份)、肺臟(174份)、膿液(83份)中擴增出與預期大小相符的目的條帶。對280條臨床樣本中擴增所得陽性條帶的序列測定和序列分析結(jié)果顯示(圖3)，所得序列是化膿隱秘桿菌PLO基因。結(jié)果表明所建立的PCR方法能有效地從臨床待檢樣本中檢測化膿隱秘桿菌。

M.DNA marker DL2000；1.陽性對照 Positive control；2.陰性對照 Negative control；3～7.臨床樣品 Clinical samples

圖3臨床樣品的檢測
Fig.3Detectionresultsofclinicalsamples

3 討 論

化膿隱秘桿菌已有PCR、LAMP等快速檢測方法[8-9]。相對于PCR方法來說，LAMP方法檢測優(yōu)點很明顯，不需要昂貴的PCR儀、檢測靈敏度高、特異性強、結(jié)果可視化等；LAMP方法檢測缺點也很明顯，核酸提取、試劑加取需要潔凈、封閉的空間以防污染，試劑成本高，操作步驟多等?；鶎荧F醫(yī)站等機構(gòu)現(xiàn)階段已配備PCR儀、電泳儀等設備，但基本沒有配備高潔凈度的實驗室或降低氣溶膠產(chǎn)生的獨立空間。因此，常規(guī)PCR方法更適合在基層推廣使用。

化膿隱秘桿菌分子檢測目前常用的靶基因主要有16S rRNA基因和PLO基因[8-9]。PLO基因在所有化膿隱秘桿菌分離菌中均能檢測到[10-11]。相對于16S rRNA基因，PLO基因在化膿隱秘桿菌更保守，是理想的檢測靶基因。但在實際應用中發(fā)現(xiàn)，基于PLO基因建立的PCR檢測方法極易與偽結(jié)核棒狀桿菌發(fā)生交叉反應，得出錯誤的檢測結(jié)果。本所對重慶養(yǎng)殖場的山羊淋巴結(jié)炎等化膿性樣本進行細菌分離鑒定，檢出率最高的是球菌，主要是釀膿葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌等；其次是桿菌，主要有溶血性曼氏桿菌、奇異變形桿菌、化膿隱秘桿菌、偽結(jié)核棒狀桿菌等?；讷F醫(yī)臨床和實驗室病原菌分離結(jié)果，采用上述細菌作為參照建立檢測化膿隱秘桿菌感染的特異性PCR檢測方法，該方法無需進行病原菌分離培養(yǎng)，可快速、準確鑒別化膿隱秘桿菌感染，為臨床治療爭取時間。