oar-miR-133的表達(dá)對(duì)巴什拜羊骨骼肌細(xì)胞增殖和分化的影響

張 偉，王世銀 ，鄧雙義，石國(guó)慶

(1. 新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831100；2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆石河子 832000)

羊肉是人類重要的動(dòng)物蛋白質(zhì)來源，提高綿羊產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)始終是綿羊育種的重要方向。綿羊產(chǎn)肉量主要受兩個(gè)因素的影響，一是骨骼肌中肌纖維的數(shù)量；二是骨骼肌纖維的粗細(xì)和長(zhǎng)度[1]。已有的研究結(jié)果表明，動(dòng)物骨骼肌纖維數(shù)量在初生前已經(jīng)基本確定。在胚胎發(fā)育階段，來源于胚胎中胚層的成肌細(xì)胞(myoblast)遷移到軀干和四肢，先進(jìn)行分裂增殖，達(dá)到一定數(shù)量后單核的成肌細(xì)胞相互融合為多核的肌管(myotube)并最終發(fā)育成肌纖維[2]，少量成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楣趋兰⌒l(wèi)星細(xì)胞(skeletal muscle satellite cell)，以靜息狀態(tài)存在于肌纖維肌膜與基底膜之間[3]。動(dòng)物初生后，肌纖維的數(shù)量不再發(fā)生變化，肌肉組織的生長(zhǎng)、肌肉量的增加，主要靠肌纖維長(zhǎng)度的生長(zhǎng)以及周徑的增加來實(shí)現(xiàn)[2]。但是當(dāng)肌肉組織受到損傷或者外界的刺激，例如人的體育鍛煉、賽馬的訓(xùn)練以及役用家畜參加高強(qiáng)度的勞動(dòng)等，肌肉組織需要修復(fù)或者再生，以維持組織的完整性或者使肌組織能夠適應(yīng)高強(qiáng)度的工作時(shí)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞便被激活而完成上述過程[4]。

miRNA(microRNA)是一類小分子非編碼RNA，約為22個(gè)核苷酸大小，通過與其靶基因mRNA互補(bǔ)結(jié)合造成mRNA降解或翻譯抑制，從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝、發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程，超過35%的人類基因受miRNA調(diào)控[5]，目前miRBase已收錄miRNA的已達(dá)38 592條(http://www.mirbase.org/，Release 22)。近年來，miRNA對(duì)綿羊骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機(jī)制已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其中對(duì)Texel羊雙肌性狀分子機(jī)制的闡釋最為經(jīng)典。Texel羊是優(yōu)良的肉羊品種，具有明顯的雙肌性狀。Clop等[6]的研究結(jié)果表明，Texel羊myostatin基因3′-UTR區(qū)發(fā)生了g+6223G/A突變，恰好成為miR-1和miR-206的靶位點(diǎn)，使該基因的表達(dá)受到抑制，其對(duì)骨骼肌發(fā)育的抑制作用解除，進(jìn)而引起Texel羊骨骼肌過度發(fā)育，表現(xiàn)出雙肌性狀。

oar-miR-133在小鼠骨骼肌和心肌中高表達(dá)，通過促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖而參與小鼠肌肉組織生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控[7]。綿羊oar-miR-133位于13號(hào)染色體上[8]，但其在綿羊骨骼肌發(fā)育過程中的生物學(xué)功能尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。巴什拜羊是新疆優(yōu)良的羔羊肉型地方綿羊品種，其優(yōu)良的肉質(zhì)性狀在國(guó)內(nèi)外綿羊品種中并不多見。在自然放牧情況下，4、5月齡羔羊平均日增質(zhì)量300 g左右，平均體質(zhì)量可達(dá)35 kg，屠宰率高達(dá)56%，胴體質(zhì)量19.66 kg，凈肉率45.7%，骨肉比1∶4.1，名列世界前茅，且羊肉品質(zhì)高，素有“貴族羊”之稱[9]，但其優(yōu)良肉質(zhì)性狀的分子調(diào)控機(jī)制尚未被闡明。鑒于此，本試驗(yàn)對(duì)oar-miR-133在巴什拜羊不同組織及不同發(fā)育階段骨骼肌中的表達(dá)情況，及其對(duì)巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的影響進(jìn)行初步研究，以期為巴什拜羊的持續(xù)選育提高提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集巴什拜羊胎兒期40 d、60 d、80 d、100 d和120 d，以及初生當(dāng)天、6月齡和周歲階段后肢骨骼肌，同時(shí)采集胎兒期第100天時(shí)心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、心肌和大腦組織。以上組織采集后立即投入液氮速凍，然后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 序列獲取及引物設(shè)計(jì)

以β-actin基因的表達(dá)作為內(nèi)參基因，對(duì)oar-miR-133的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。根據(jù)miRBase中收錄的綿羊(Ovis aris) oar-miR-133序列(MI0014122)及GenBank中公布的牛(Bostaurus)β-actin序列(NM_173979.3)和MyHC序列(NM_174117.1)序列設(shè)計(jì)RT-PCR引物。oar-miR-133反轉(zhuǎn)錄引物采用特殊的頸環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)引物[10]，β-actin基因RT-PCR引物使用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物相關(guān)信息見表1。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按照TRIzol(Invitrogen，美國(guó))說明提取各組織總RNA，使用分光光度計(jì)(ND2000，Thermo，美國(guó))結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量及濃度。按照M-mLV Reverse Transcriptase 試劑盒(Invitrogen，美國(guó))的操作要求反轉(zhuǎn)錄得到oar-miR-133和β-actin的cDNA，其中oar-miR-133的反轉(zhuǎn)錄引物見表1，β-actin的反轉(zhuǎn)錄引物為試劑盒自帶的引物oligo(dT)[12-18]。

表1 oar-miR-133、MyHC和β-actin反轉(zhuǎn)錄引物及RT-PCR引物Table 1 RT-PCR and reverse transcription primers of oar-miR-133,MyHC and β-actin

注：引物oar-miR-133RTP帶下劃線的堿基為與oar-miR-133序列5′端互補(bǔ)的8個(gè)堿基，引物oar-miR-133qL帶下劃線的堿基為oar-miR-133序列3′端的14個(gè)堿基。

Note: Bases of primer oar-miR-133 with underlines were complementary with 8 bases of 5′ end sequence of oar-miR-133, and the ones of primer oar-miR-133qL and 5sqL were 14 bases of 3′ end sequence of oar-miR-133.

1.4 RT-PCR擴(kuò)增及qRT-PCR定量檢測(cè)

以胎兒期第100天各組織cDNA為模板，對(duì)巴什拜羊不同組織中oar-miR-133的表達(dá)情況進(jìn)行半定量分析，擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL體系：10×PCR buffer 2.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，cDNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2.5 g/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

不同發(fā)育階段骨骼肌組織和不同發(fā)育狀態(tài)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中oar-miR-133表達(dá)量的變化采用qRT-PCR進(jìn)行精確定量分析。反應(yīng)體系共計(jì)20 μL：SYBR Green master mix 2×(Thermo，美國(guó)) 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：激活50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；循環(huán)95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

1.5 巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

從液氮罐中取出一管凍存的巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室通過原代分離培養(yǎng)獲得)，迅速置于50 ℃水浴中，待完全融化后取出，吸水紙擦干，φ=75%酒精認(rèn)真擦拭凍存管外壁進(jìn)行徹底消毒，然后轉(zhuǎn)入15 mL無菌離心管中，加入10 mL DMEM培養(yǎng)基，離心棄上清后用完全培養(yǎng)基(φ=84%DMEM+φ=15%胎牛血清+φ=1%雙抗)重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)入6 cm培養(yǎng)皿中，加入適量完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)皿底80%，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的誘導(dǎo)分化采用低血清培養(yǎng)基完成，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)皿底80%左右時(shí)，更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(φ=97% DMEM/F-12+φ=2%馬血清+φ=1%雙抗)，同時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)分化狀態(tài)。

上述處于增殖、分化狀態(tài)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，培養(yǎng)至第5天時(shí)收集細(xì)胞，提取總RNA，采用qRT-PCR檢測(cè)不同狀態(tài)時(shí)oar-miR-133表達(dá)量的變化。

1.6 巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞oar-miR-133表達(dá)干擾

巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中oar-miR-133的過表達(dá)和抑制表達(dá)，通過轉(zhuǎn)入外源的oar-miR-133 mimics和inhibitor實(shí)現(xiàn)。將骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞接種至6孔板，共接種35孔，每孔約5 000個(gè)細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)。參照Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國(guó))操作說明將人工合成的oar-miR-133 mimics和inhibitor及其陰性對(duì)照(由吉瑪基因合成，序列見表2)轉(zhuǎn)入巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，不轉(zhuǎn)染任何試劑作為空白對(duì)照組，每個(gè)處理轉(zhuǎn)染7孔細(xì)胞，共計(jì)35孔細(xì)胞。每個(gè)處理留1孔細(xì)胞觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，其余6孔每隔24 h消化1孔，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，以評(píng)估各處理對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

表2 oar-miR-133 mimics、oar-miR-133 inhibitor及其陰性對(duì)照序列Table 2 Sequence of oar-miR-133 mimics, oar-miR-133 inhibitor and their negative controls

1.7 oar-miR-133靶基因預(yù)測(cè)及分析

采用TargetScan軟件預(yù)測(cè)oar-miR-133靶基因，條件設(shè)置為總背景值(total context score)小于-0.5，總Pct值(aggregate Pct)大于0.4，得到的預(yù)測(cè)結(jié)果再與miRanda和Pictar 2個(gè)軟件獨(dú)立預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，取至少出現(xiàn)在2個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果中的靶基因進(jìn)行分析[11]。使用Blast2GO對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行功能注釋[12-13]，并采用KOBA2.0(KEGG Orthology Based Annotation System)對(duì)其參與的KEGG通路進(jìn)行分析[14-15]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

oar-miR-133的表達(dá)量采用2-△△Ct計(jì)算，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，不同發(fā)育階段骨骼肌組織以胎兒期第100 天的表達(dá)量作為對(duì)照，不同發(fā)育狀態(tài)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞以誘導(dǎo)分化狀態(tài)的表達(dá)量為對(duì)照進(jìn)行相對(duì)定量。對(duì)結(jié)果采用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 oar-miR-133在巴什拜羊骨骼肌中的表達(dá)情況

從各個(gè)組織中提取的總RNA無明顯降解(圖1-A)，OD260/OD280比值在1.8～2.2之間，表明提取的總RNA質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

oar-miR-133在巴什拜羊不同組織中的表達(dá)量存在明顯的差異，在心肌和骨骼肌中高表達(dá)，在肺、腸和胃中表達(dá)量較低，未檢測(cè)到oar-miR-133表達(dá)或者表達(dá)量極低(圖1-B)。

在巴什拜羊骨骼肌不同發(fā)育階段，oar-miR-133的表達(dá)量出現(xiàn)了較大的波動(dòng)(圖1-C)。胎兒期第40 天(E40)和第60 天(E60)表達(dá)量很低，第80 天(E80)前后表達(dá)量迅速上升，至第100天(E100)時(shí)達(dá)到峰值，其后迅速降低，至第120天(E120)時(shí)降至較低表達(dá)水平，其后又小幅上升，至初生時(shí)達(dá)到較高的表達(dá)量，后又逐漸下降至較低的表達(dá)水平，直至周歲。巴什拜羊不同發(fā)育階段骨骼肌中oar-miR-133表達(dá)量的波動(dòng)與其骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的關(guān)聯(lián)性，尚需后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

A.巴什拜羊部分組織提取總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，1～4泳道分別為骨骼肌、腸、腎和肝組織 Agarose gel electrophoresis image of total RNA of Bashbay sheep, 1-4 lane is skeletal muscle, intestine, kidney and liver tissue respectively；B.巴什拜羊不同組織中oar-miR-133表達(dá)情況，1～10泳道分別是肺、肝、脾、腎、胃、腸、腦、脂肪、心肌和骨骼肌 Expression of oar-miR-133 in different tissues of Bashbay sheep, 1-10 lane is lung, liver, spleen, kidney, stomach, intestine, brain, fat, cardiac muscle and skeletal muscle；C.巴什拜羊骨骼肌不同發(fā)育階段oar-miR-133表達(dá)量變化 Expression of oar-miR-133 at different development stages of Bashbay sheep skeletal muscle

圖1巴什拜羊不同組織和不同發(fā)育階段骨骼肌中oar-miR-133表達(dá)情況
Fig.1Expressionofoar-miR-133indifferenttissuesandatdifferentdevelopmentstagesofskeletalmuscleofBashbaysheep

2.2 巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化狀態(tài)下oar-miR-133的表達(dá)情況

巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞處于增殖狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞中oar-miR-133表達(dá)量較低。當(dāng)采用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞處于分化狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)oar-miR-133表達(dá)量迅速上升，顯著高于增殖狀態(tài)時(shí)的表達(dá)量(P<0.05)(圖2-A)。說明巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖狀態(tài)和分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，可能與oar-miR-133表達(dá)量的上調(diào)存在關(guān)聯(lián)性。

2.3 oar-miR-133過表達(dá)和抑制表達(dá)對(duì)巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞狀態(tài)的影響

為了進(jìn)一步研究oar-miR-133表達(dá)量的變化與巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性。通過轉(zhuǎn)染oar-miR-133 mimics和oar-miR-133 inhibitor進(jìn)入骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，造成細(xì)胞內(nèi)oar-miR-133的水平上調(diào)或下調(diào)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞內(nèi)oar-miR-133的水平上調(diào)時(shí)(轉(zhuǎn)入oar-miR-133 mimics組)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖受到抑制(圖2-B-e和圖2-D)，而其余處理組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與空白對(duì)照組未見明顯差異(圖2-B-a, b, c, d和圖2-D)。另外，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)oar-miR-133的水平上調(diào)時(shí)，即使培養(yǎng)基中的血清體積分?jǐn)?shù)保持在15%，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞仍然停止增殖轉(zhuǎn)入分化狀態(tài)，細(xì)胞有相互融合形成肌管的趨勢(shì)(圖2-B-e和圖2-D)，同時(shí)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中標(biāo)志著細(xì)胞分化的MyHC基因高表達(dá)，而同期的其他處理組細(xì)胞中未檢測(cè)到該基因的表達(dá)(圖2-C)。

綜合以上數(shù)據(jù)，可以確定oar-miR-133表達(dá)量的上調(diào)，與巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程的啟動(dòng)密切相關(guān)。

2.4 oar-miR-133靶基因預(yù)測(cè)及分析

使用TargetScan軟件預(yù)測(cè)oar-miR-133靶基因，共得到128個(gè)預(yù)測(cè)的靶基因。經(jīng)與miRanda和Pictar 2個(gè)軟件獨(dú)立預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，選擇至少出現(xiàn)在2個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果中的靶基因，最終得到96個(gè)符合條件的預(yù)測(cè)靶基因。

使用Blast2GO分別對(duì)預(yù)測(cè)的96個(gè)靶基因進(jìn)行功能注釋，有74個(gè)靶基因得到注釋信息，其中分別有23(31%)、18(24%)和33(45%)的候選靶基因分別參與分子功能(molecular function, MF)、細(xì)胞成分(cellular component, CC)和生物過程(biological process, BP)(圖3)。

為了進(jìn)一步了解oar-miR-133預(yù)測(cè)靶基因的功能，采用KOBA2.0(KEGG Orthology Based Annotation System)對(duì)其參與的KEGG通路進(jìn)行分析，共有82個(gè)預(yù)測(cè)靶基因參與35條KEGG通路，例如MAPK信號(hào)通路(map04010)、WNT信號(hào)通路(map04310)和心肌收縮(map04260)等重要的通路。表3中列出了參與的部分KEGG通路。

A.骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化狀態(tài)oar-miR-133表達(dá)量變化，不同字母表示差異顯著(P<0.05) Expression of oar-miR-133 in proliferative and differentiated skeletal muscle satellite cells, different letters mean significant difference(P<0.05)；B.轉(zhuǎn)染空白對(duì)照(a)、oar-miR-133 mimics陰性對(duì)照(b), oar-miR-133 inhibitor(c),oar-miR-133 inhibitor 陰性對(duì)照(d)和oar-miR-133 mimics(e)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)(放大200×) States of skeletal muscle satellite cells transfected blank(a), oar-miR-133 mimics(b), oar-miR-133 inhibitor(c), oar-miR-133 inhibitor(d) and oar-miR-133 mimics(e) respectively；C.不同轉(zhuǎn)染組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中MyHC基因表達(dá)情況，M為100 bp Marker，1～5泳道分別為轉(zhuǎn)染oar-miR-133 mimics、oar-miR-133 mimics陰性對(duì)照、oar-miR-133 inhibitor,oar-miR-133 inhibitor 和空白對(duì)照組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞組 Expression ofMyHCgene in transfected skeletal muscle satellite cells, M lane is 100 bp Marker, 1-5 lane is skeletal muscle satellite cells transfected oar-miR-133 mimics, oar-miR-133 mimics negative control, oar-miR-133 inhibitor , oar-miR-133 inhibitor negative control and blank control respectively；D.oar-miR-133表達(dá)量對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 Effect of oar-miR-133 expression on proliferation of skeletal muscle satellite cells

圖2 Oar-miR-133表達(dá)量與巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系Fig.2 Relationship between oar-miR-133 expression and development of skeletal muscle satellite cell of Bashbay sheep

3 討 論

3.1 oar-miR-133的組織表達(dá)特征

目前，miRBase V22.0收錄的miRNA已達(dá)38 589條(http://www.mirbase.org/)，其中有一些miRNA的表達(dá)具有明顯的組織特異性，例如miR-1、miR-133家族、miR-206和miR-208a/b等僅在骨骼肌和心肌中表達(dá)[16-18]，又被稱為肌肉miRNA。本研究采用RT-PCR對(duì)巴什拜羊胎兒期第100天時(shí)心肌、骨骼肌、肝、脾、肺、腎、胃、腸、脂肪、腦等10個(gè)組織中oar-miR-133的表達(dá)情況進(jìn)行半定量檢測(cè)，結(jié)果表明oar-miR-133除了在 巴什拜羊骨骼肌和心肌中高表達(dá)，還在胃、腸和肺組織中微量表達(dá)(圖1-B)。由于胃和腸主要是由平滑肌組織構(gòu)成，推測(cè)oar-miR-133可能也在巴什拜羊平滑肌組織的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮作用，相關(guān)調(diào)控機(jī)制未見文獻(xiàn)報(bào)道，需要后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

A.預(yù)測(cè)靶基因GO功能注釋 GO functional annotation of predicted target genes of oar-miR-133；B.預(yù)測(cè)靶基因參與的細(xì)胞組分調(diào)控情況 Predicted target genes participating regulation of cellular component；C.預(yù)測(cè)靶基因參與分子功能調(diào)控情況 Predicted target genes participating regulation of molecular function；D.預(yù)測(cè)靶基因參與生物過程調(diào)控情況 Predicted target genes participating regulation of biological process

圖3Oar-miR-133預(yù)測(cè)靶基因功能GO分析
Fig.3GOfunctionanalysisofpredictedtargetgenesofoar-miR-133

miR-133參與骨骼肌發(fā)育的調(diào)控已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠miR-133和miR-1成簇排列，位于第2和第18號(hào)染色體上，但二者獨(dú)立完成轉(zhuǎn)錄，對(duì)小鼠骨骼肌發(fā)育的調(diào)控作用也存在很大的差異，miR-133可通過抑制肌源性基因的表達(dá)而抑制成肌細(xì)胞的分化，使其保持增殖狀態(tài)，而miR-1的表達(dá)可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)，相互融合為肌管[17]。綿羊oar-miR-133位于13號(hào)染色體上[8]，巴什拜羊骨骼肌發(fā)育不同時(shí)期oar-miR-133的表達(dá)量有較大的波動(dòng)，尤其是在胎兒期第100天前后oar-miR-133的表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的上調(diào)(圖1-C)。由于胎兒期是骨骼肌組織發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，推測(cè)oar-miR-133表達(dá)量的變化可能與其成肌細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控有關(guān)。

進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，當(dāng)巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞處于增殖狀態(tài)時(shí)oar-miR-133處于低表達(dá)水平，而當(dāng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞處于誘導(dǎo)分化狀態(tài)時(shí)oar-miR-133的表達(dá)量迅速上調(diào)(圖2-A)。另外，當(dāng)通過轉(zhuǎn)入oar-miR-133 mimics使巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中oar-miR-133的水平上升時(shí)，巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞即使處于增殖培養(yǎng)基中，也停止增殖轉(zhuǎn)而進(jìn)入分化狀態(tài)(圖2-B,2-C,2-D)。由此可以確定，在巴什拜羊生長(zhǎng)發(fā)育過程中，oar-miR-133通過誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化而參與巴什拜羊骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，進(jìn)而影響其產(chǎn)肉性能和肉質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在小鼠骨骼肌中miR-133的上調(diào)可抑制成肌細(xì)胞分化，使其保持增殖狀態(tài)[17]。另外，在瘦肉型豬和脂肪型豬品種骨骼肌的發(fā)育過程中，miR-133等骨骼肌中特異表達(dá)的miRNA的表達(dá)模式也存在顯著差異[19]，而經(jīng)雌激素處理的虹鱒魚，骨骼肌中miR-133的表達(dá)量顯著上調(diào)，進(jìn)而骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制[20]。由此推斷miR-133的表達(dá)及其作用可能存在物種甚至品種差異性，具體機(jī)制有待后續(xù)深入研究。

3.2 oar-miR-133調(diào)控的靶基因

miRNA通過調(diào)控靶基因而發(fā)揮其生物學(xué)功能，所以確定miRNA調(diào)控的靶基因是進(jìn)一步研究其生物功能基礎(chǔ)。但是，由于miRNA與其靶基因作用的復(fù)雜性，以及動(dòng)物miRNA與其靶基因并非通過完全堿基互補(bǔ)進(jìn)行結(jié)合，所以到目前為止已經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miR-133靶基因數(shù)量還非常有限。巴什拜羊oar-miR-133通過調(diào)控哪些靶基因而誘導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的是一個(gè)值得深入研究的問題。已有研究結(jié)果表明，miR-133可以通過調(diào)控Prdm16基因而影響小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為肌組織還是褐色脂肪組織[21]。在C2C12細(xì)胞中，miR-133通過調(diào)控血清應(yīng)答因子(Serum response factor,SRF)的表達(dá)而抑制肌細(xì)胞的分化，而miR-133的表達(dá)又受長(zhǎng)鏈非編碼RNA Malat1的調(diào)控[22]。另外，在大鼠心肌中miR-133可以通過抑制Caspase-9的表達(dá)而延緩心肌細(xì)胞的凋亡[23]。但在巴什拜羊骨骼肌發(fā)育過程中oar-miR-133調(diào)控的靶基因尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)分析的方法共預(yù)測(cè)到oar-miR-133的靶基因96個(gè)，GO分析結(jié)果表明共有74個(gè)預(yù)測(cè)靶基因分別參與分子功能(molecular function, MF)、細(xì)胞成分(cellular component, CC)和生物過程(biological process, BP)等重要的細(xì)胞生物學(xué)過程(圖3)。靶基因參與KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果表明，共有82個(gè)預(yù)測(cè)靶基因參與35條KEGG通路，其中涉及一些諸如肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控(map04810)、MAPK信號(hào)通路(map04010)等重要的信號(hào)通路。但是由于生物信息學(xué)分析結(jié)果存在較大比例的假陽(yáng)性結(jié)果，所以后期需要通過實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證最終確定oar-miR-133調(diào)控的靶基因，以便更為準(zhǔn)確地解析其調(diào)控巴什拜羊骨骼肌發(fā)育的分子機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)巴什拜羊不同組織和不同發(fā)育階段骨骼肌中oar-miR-133的表達(dá)情況進(jìn)行研究，初步揭示oar-miR-133的表達(dá)與巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化狀態(tài)轉(zhuǎn)換的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明oar-miR-133對(duì)巴什拜羊骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，相關(guān)研究成果將為巴什拜羊的持續(xù)選育提高提供理論依據(jù)。