3種止痢型中獸藥液體制劑中非法添加黏菌素的HPLC-PDA檢查方法的建立

韓寧寧 ， 劉 暢 ， 于曉輝 ， 范 強(qiáng) ， 趙 暉 ， 董玲玲 ， 楊秀玉 ， 萬(wàn)仁玲

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京 海淀 100081；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) ， 廣東 廣州 510642)

黏菌素，又稱(chēng)多黏菌素，是從多黏桿菌培養(yǎng)液中分離出的一種多組分的多肽類(lèi)抗生素。由于黏菌素對(duì)革蘭陰性桿菌(大腸埃希菌等)引起的腸道感染具有良好的治療效果，有不法中獸藥制劑生產(chǎn)企業(yè)將其添加于用于止痢的口服液或注射液中，以增強(qiáng)療效。該處方外非法添加行為嚴(yán)重?cái)_亂了獸藥市場(chǎng)秩序，影響了畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，應(yīng)予以制止與懲戒。但由于黏菌素在《中國(guó)獸藥典》中含量測(cè)定方法為效價(jià)法，目前仍沒(méi)有針對(duì)止痢型中獸藥液體制劑中非法添加黏菌素的檢查方法。本研究旨在建立一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的高效液相色譜法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)止痢型中獸藥液體制劑中添加黏菌素進(jìn)行定性定量檢測(cè)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀，Waters2695，配二極管陣列檢測(cè)器2998(PDA)；電子天平AX205，梅特勒-托利多。

1.2 藥品

1.2.1 黏菌素對(duì)照品 批號(hào)/來(lái)源/含量：K0271305/中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所/22782單位/mg。

1.2.2 空白止痢型中獸藥液體制劑 楊樹(shù)花口服液(來(lái)源/批號(hào)/規(guī)格：佛山市南海禪泰動(dòng)物藥業(yè)有限公司/161003/1 mL相當(dāng)于原生藥1 g)；板藍(lán)根注射液(來(lái)源/批號(hào)/規(guī)格：江西鑫維藥業(yè)有限公司/20151201/1 mL相當(dāng)于原生藥0.5 g)；小檗堿注射液(來(lái)源/批號(hào)/規(guī)格：長(zhǎng)沙拜特生物科技研究所有限公司/20151201/10 mL：0.1g)。

1.3 試劑 乙腈，色譜純，德國(guó)Merck公司；硫酸鈉、磷酸，分析純，國(guó)家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件 采用Waters HSS T3C18色譜柱，250×4.6 mm，5 μm。流動(dòng)相為乙腈∶硫酸鈉磷酸水溶液(20∶80)，硫酸鈉磷酸水溶液∶硫酸鈉水溶液(7 g/L)：磷酸水溶液(6.8%)(50.5∶22.75)。采集波長(zhǎng)200～400 nm，分辨率1.2 nm，提取波長(zhǎng)215 nm。流速1.0 mL/min。進(jìn)樣量20 μL。柱溫30 ℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 制劑空白溶液 分別取楊樹(shù)花口服液、板藍(lán)根注射液、小檗堿注射液1 mL，置100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

2.2.2 專(zhuān)屬性溶液 分別取楊樹(shù)花口服液、板藍(lán)根注射液、小檗堿注射液1 mL，置100 mL容量瓶中，分別加黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加水稀釋至刻度，搖勻即得。進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

2.2.3 檢出限溶液 將黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解配制為2 mg/mL的母液。取楊樹(shù)花口服液1 mL，置100 mL容量瓶中，加上述母液5 mL，加水稀釋至刻度，搖勻即得；取板藍(lán)根注射液1 mL，加上述母液 2 mL，加水稀釋至刻度，搖勻即得；取小檗堿注射液1 mL，加上述母液2 mL，加水稀釋至刻度，搖勻即得。進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

2.2.4 線性溶液 將黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解配制為2 mg/mL的母液，作為線性溶液⑤。分別取上述母液 1 mL、5 mL、5 mL、5 mL分別置50 mL、50 mL、25 mL、10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻得線性溶液①、②、③、④。

2.2.5 回收率溶液 取楊樹(shù)花口服液、板藍(lán)根注射液、小檗堿注射液各1 mL，分別置100 mL容量瓶中，加黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加水稀釋至刻度，搖勻即得。進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

3 結(jié)果

3.1 專(zhuān)屬性 板藍(lán)根注射液本底對(duì)黏菌素E1及E2色譜峰均無(wú)影響；楊樹(shù)花口服液及小檗堿注射液本底均有色譜峰與黏菌素E2重合，但對(duì)E1無(wú)影響。故選取黏菌素E1峰作為目標(biāo)峰。黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖及三種制劑空白溶液色譜圖見(jiàn)圖1～圖4。

圖1 黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖2 板藍(lán)根注射液制劑空白溶液色譜

圖3 楊樹(shù)花口服液制劑空白溶液色譜

圖4 小檗堿注射液制劑空白溶液色譜

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 以峰面積為(y)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=2.9E6x-20762，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，表明黏菌素E1在0.04～2 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 檢出限 將PDA光譜圖平滑無(wú)鋸齒狀波動(dòng)，且純度角度大于純度閾值、PDA匹配角度大于PDA匹配閾值作為檢出限評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，得3種制劑檢出限分別為：板藍(lán)根注射液4 mg/mL、小檗堿注射液4 mg/mL、楊樹(shù)花口服液10 mg/mL。

3.4 回收率 3種止痢型中獸藥液體制劑中黏菌素的添加回收率為95.9%～97.9%，RSD為0.9%～1.8%，表明該方法回收率良好，準(zhǔn)確度符合《中國(guó)獸藥典》獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[3]的要求。見(jiàn)表1。

表1 3種止痢型中獸藥液體制劑中黏菌素E1添加回收率

4 討論與小結(jié)

4.1 止痢型中獸藥液體制劑的選擇 止痢型中獸藥液體制劑，除本方法建立中使用到的楊樹(shù)花口服液、板藍(lán)根注射液、小檗堿注射液外，還有雙黃連口服液、雙黃連注射液、金芩芍注射液等。但后3種制劑即便與微量黏菌素混合亦會(huì)產(chǎn)生絮狀沉淀，分析可能是黏菌素的酸性成分使制劑中的蛋白類(lèi)成分發(fā)生變性所致。故后3種制劑不可能存在處方外非法添加黏菌素的可能，因而本研究選擇了上述前3種液體制劑作為供試品空白制劑。

4.2 色譜方法中流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本方法所選用的流動(dòng)相系統(tǒng)參考了文獻(xiàn)[4]：乙腈∶硫酸鈉水溶液(7g/L)：磷酸水溶液(6.8%)(22.25∶50.5∶22.75)，并對(duì)該系統(tǒng)中有機(jī)相與水相的比例進(jìn)行了細(xì)微調(diào)節(jié)，以使上述3種中獸藥制劑的本底色譜峰均可與黏菌素E1峰實(shí)現(xiàn)良好分離。另外，文獻(xiàn)[4]選取的提取波長(zhǎng)為205 nm，雖然與215 nm比較，205 nm下黏菌素E1的紫外吸收強(qiáng)度更強(qiáng)，但中獸藥制劑的本底色譜峰干擾亦更強(qiáng)。為保證黏菌素E1與本底色譜峰的良好分離，選取干擾更低的215 nm作為提取波長(zhǎng)。