馬蹄黃總黃酮抗炎 鎮(zhèn)痛和止血作用研究

李 玲 , 李宇涵 , 郭思銀 , 代 璐 , 馮皓媛 , 陳朝喜

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 , 四川 成都 610041)

馬蹄黃(Spenceria ramalana Trimen)屬薔薇科馬蹄黃屬多年生草本，主要產(chǎn)于四川、云南、西藏等省份和地區(qū)，常生長在海拔3 000～5 000 m的高山草原石灰?guī)r山坡。據(jù)《中華人民共和國藥典》記載，馬蹄黃味苦、性寒，歸脾、胃、大腸、肝和心包經(jīng)[1]；其根可入藥，具有解毒消炎、收斂止血、止瀉和止痢等作用[2]。馬蹄黃是我國藏族傳統(tǒng)民間用藥，是我國特有的植物，但目前對該藥的研究較少，Lee 等人研究馬蹄黃原花青素成分對體內(nèi)高聚糖終產(chǎn)物形成和體內(nèi)幼蟲斑馬魚的玻璃體-視網(wǎng)膜血管擴張的影響[3]，然而并未深入研究其藥理學(xué)作用。近年來，植物藥以其天然低毒的特點備受青睞，而黃酮類化合物以其廣泛的藥理學(xué)作用尤為引人矚目[4]。相關(guān)研究表明，植物藥物中黃酮類化合物在降血糖[5-6]、降血壓[7-9]、抗腫瘤[10-12]等方面具有良好功效。研究初步證實馬蹄黃含有黃酮類化合物，對其抗炎、鎮(zhèn)痛和止血作用進行探討，以期為其在獸醫(yī)臨床應(yīng)用提供更廣泛的用藥選擇，并為其藥用價值深入研究及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物 ICR小鼠，體重在18～22 g之間，雌雄兼用，由成都達碩實驗動物有限公司提供。

1.2 藥物與試劑 馬蹄黃采自四川省甘孜州色達縣丹青藥王神山，由西南民族大學(xué)陳朝喜副教授鑒定為薔薇科馬蹄黃屬馬蹄黃的全草；AB-8型大孔吸附樹脂(鄭州勤實科技有限公司)；三氯化鋁、檸檬酸三鈉(成都市科龍化工試劑廠)；冰醋酸(天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號20180133)；二甲苯(西安化學(xué)試劑廠)；角叉萊膠(上海伊卡生物技術(shù)有限公司)；云南白藥(云南白藥集團股份有限公司，批號Z53020798)；阿司匹林(石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，批號H20153035)；凝血酶原時間測試盒、凝血酶時間測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20180514)；無水乙醇(成都金山化學(xué)試劑有限公司，批號20180314)。

1.3 儀器與設(shè)備 HC-10型多功能測厚儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；YLS-6B型智能熱板儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；D-37520高速離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；WFH-203B三用紫外分析儀(上海馳唐電子有限公司)；PL303電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-DIII循環(huán)水真空泵、DLSB-10/20低溫冷卻液循環(huán)泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；LGJ-10真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 馬蹄黃總黃酮提取 參考并改進文獻[13]方法進行馬蹄黃總黃酮提取，具體操作步驟如下：取干燥馬蹄黃2 kg，粉碎后過40目藥典篩，10 L 70%乙醇浸泡3 d，過濾，將其濾液減壓濃縮至1 g/L，加等體積水，冷卻，過濾，濾液與AB-8大孔樹脂柱吸附24 h 后，依次用水、10%乙醇、30%乙醇、70%乙醇洗脫，濃縮各個梯度洗脫液，經(jīng)薄層檢測(展開劑∶甲醇∶乙酸乙酯∶水=3∶0.8∶0.4)，噴霧1%三氯化鋁乙醇溶液。

2.2 馬蹄黃總黃酮急性毒性試驗 參考文獻[14]方法進行：隨機將ICR小鼠分為4組，每組4只，禁食16 h后分別灌胃給予500、1 000、5 000 mg/kg·bw馬蹄黃總黃酮，空白對照組給予小鼠0.4 mL/20 g·bw的蒸餾水，自由飲食、飲水，觀察48 h。

2.3 馬蹄黃總黃酮的抗炎試驗

2.3.1 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 取ICR小鼠40只，雌雄兼用，分為5組，分別灌胃給予高(800 mg/kg·bw)、中(400 mg/kg·bw)、低(200 mg/kg·bw)劑量的馬蹄黃總黃酮提取物，陽性和陰性對照組分別給藥阿司匹林(50 mg/kg·bw)和等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥前用測厚儀測量每只小鼠右耳厚度作為正常值，末次給藥后0.5 h，在每只小鼠右耳背涂20 μL二甲苯，1 h后測量每只小鼠右耳的厚度。致炎前后的厚度差即為腫脹值，腫脹抑制率= (對照組腫脹值-給藥組腫脹值)/對照組腫脹值×100%，試驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行單因素方差分析，下同。

2.3.2 對角叉萊膠致小鼠足跖腫脹的影響 參考文獻[15]，按照“2.3.1”項的分組和給藥方法，以云南白藥(50 mg/kg·bw)為陽性對照組。末次給藥后30 min，于每只小鼠右后肢足跖部皮下注射1%角叉萊膠50 μL/只，3 h后頸椎脫臼處死小鼠，于踝關(guān)節(jié)處剪下左右后肢稱重，以兩肢重量之差作為足跖腫脹度。

2.4 馬蹄黃總黃酮的鎮(zhèn)痛試驗

2.4.1 對小鼠熱板法鎮(zhèn)痛作用的影響 參考文獻[16]，40只雌性ICR小鼠按照“2.3.1”項的分組和給藥方法，于給藥前將每只小鼠放在智能熱板儀上，溫度控制在(55±0.5)℃，記錄小鼠自放置熱板到出現(xiàn)舔后足所需時間作為該鼠的痛域值。于末次給藥15 min，30 min，60 min后分別記錄每只小鼠的痛閾值。若小鼠在熱板上60 s無舔后足行為則立即取出，以免燙傷小鼠，其痛閾值按60 s計算。

2.4.2 對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響 參考文獻[16]，按照“2.3.1”項的分組和給藥方法，于末次給藥2 h后向每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.8%醋酸溶液0.1 mL/10 g·bw，觀察小鼠15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)(腹部內(nèi)凹，軀干與后腿伸展、臀部高起、蠕行)次數(shù)，計算鎮(zhèn)痛率。鎮(zhèn)痛率=(空白對照組平均扭體反應(yīng)次數(shù)-給藥組平均扭體反應(yīng)次數(shù))/對照組平均扭體反應(yīng)次數(shù)。

2.5 馬蹄黃總黃酮的止血試驗

2.5.1 對小鼠斷尾出血時間的影響 參考文獻[17]，按照“2.3.1”項的分組和給藥方法，以云南白藥(50 mg/kg·bw)為陽性組。于末次給藥0.5 h后，采用斷尾法測定小鼠止血時間。將小鼠固定，用利剪將小鼠尾尖0.5 cm處剪斷，待血液自然流出后，開始計時，每隔30 s用濾紙吸去血滴，直至濾紙吸時無血為止，停止計時，此時間即為出血時間。

2.5.2 對血漿凝血酶時間(TT)的影響 參考文獻[17]，按照“2.3.1”項的分組和給藥方法，以云南白藥(50 mg/kg·bw)為陽性對照組。每只小鼠斷頭采血0.45 mL，加入裝有0.05 mL 3.8%檸檬酸三鈉的離心管中，以3 000 r/min離心15 min，收集血漿。取血漿100 μL于離心管中，37 ℃水浴內(nèi)孵育3 min后，加入預(yù)熱至37 ℃的TT試劑100 μL，立即混勻，開始記時，每隔2 s傾斜離心管，直至試管液面不再流動為止，停止計時。此時間即為凝血酶時間。

2.5.3 對血漿凝血酶原時間(PT)的影響 參考文獻[17]，取“2.5.2”項中的血漿50 μL于離心管中，37 ℃水浴內(nèi)孵育3 min后，加入預(yù)熱至37 ℃的PT試劑100 μL，立即混勻，開始記時，每隔2 s傾斜離心管1次，直至試管液面不再流動為止，停止計時。此時間即為血漿凝血酶原時間。

3 結(jié)果

3.1 馬蹄黃總黃酮的提取純化及其急性毒性測定 薄層層析結(jié)果表明，30%和70%乙醇洗脫液在365 nm紫外燈下顯亮黃色熒光，表明馬蹄黃總黃酮富集在30%和70%乙醇洗脫液中，故合并這兩部分，濃縮、干燥后得到淺黃色總黃酮粉末。

急性毒性試驗結(jié)果顯示，給予5 000 mg/kg·bw馬蹄黃總黃酮時，各試驗組小鼠均未出現(xiàn)正常行為的改變，表明本方法提取純化的總黃酮安全[14]。

3.2 馬蹄黃總黃酮抗炎作用

3.2.1 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 試驗結(jié)果見表1，從中可以看出：各劑量組的馬蹄黃總黃酮均能抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹且具有劑量依賴效應(yīng)，但只有高劑量組和陽性組與空白對照組比較有差異顯著性，且高劑量組的抑制作用略差于阿司匹林陽性對照組。

表1 馬蹄黃總黃酮對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 (x±SD)

3.2.2 對角叉萊膠致小鼠足跖腫脹的影響 試驗結(jié)果表明，馬蹄黃總黃酮低、中、高3個劑量組對角叉萊膠致小鼠足跖腫脹均有明顯的抑制作用，且中、高劑量組的抑制率優(yōu)于陽性組，其對小鼠足跖腫脹抑制率分別為8.40%、31.77%、44.14%，具有明顯的劑量依賴效應(yīng)，劑量越大，作用越強(表2)。

表2 馬蹄黃總黃酮對角叉萊膠致小鼠足跖腫脹的影響 (x±SD)

3.3 馬蹄黃總黃酮的鎮(zhèn)痛作用

3.3.1 對小鼠熱板法鎮(zhèn)痛作用的影響 與空白對照組比較，馬蹄黃總黃酮3個劑量組均能延長小鼠舔后足所需的時間，陽性對照組在30 min、60 min處的痛閾值具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，其中劑量組在30 min、60 min處的痛閾值具有顯著差異性(P<0.05)，其高劑量組在30 min、60 min處的痛閾值具有極顯著差異性(P<0.01)，且在30 min處痛閾值達到巔峰，明顯優(yōu)于陽性對照組(阿司匹林組)，提示馬蹄黃總黃酮(全身給藥)具有一定的鎮(zhèn)痛作用(表3)。

3.3.2 對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響 與空白對照組比較，馬蹄黃總黃酮各個劑量組均能減少小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，其中陽性(阿司匹林組)和高劑量組差異顯著(P<0.05)，鎮(zhèn)痛率分別為37.54%、28.04%。提示馬蹄黃總黃酮(全身給藥)具有一定的鎮(zhèn)痛作用，且具有明顯的劑量依賴效應(yīng)，劑量越大，作用越強(表4)。

表3 馬蹄黃總黃酮對小鼠熱板法鎮(zhèn)痛作用的影響 (x±SD)

表4 馬蹄黃總黃酮對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響 (x±SD)

3.4 馬蹄黃總黃酮的止血作用

3.4.1 對小鼠斷尾出血時間的影響 與空白對照組比較，馬蹄黃總黃酮各個劑量組均可縮短小鼠出血時間，但低劑量組作用不明顯(P>0.05)，而中、高劑量組效果顯著(P<0.05)，且高劑量組略優(yōu)于陽性組，提示馬蹄黃總黃酮具有一定的止血作用(表5)。

3.4.2 對血漿凝血酶時間(TT)的影響 與空白對照組比較，馬蹄黃總黃酮中、高劑量組可使凝血酶時間縮短，且高劑量組優(yōu)于陽性組，而低劑量組卻未能減少凝血酶時間。因此，馬蹄黃總黃酮對血漿凝血酶時間(TT)的影響取決于劑量的大小，劑量越大，作用越強(表5)。

3.4.3 對血漿凝血酶原時間(PT)的影響 試驗結(jié)果表明，與空白對照組比較，陽性組和馬蹄黃總黃酮低、中、高劑量組均可顯著縮短凝血酶原時間(P<0.05)，其中高劑量組效果極為顯著(P<0.01)，且明顯優(yōu)于陽性組(表5)。

表5 馬蹄黃總黃酮對小鼠斷尾出血時間、血漿凝血酶時間(TT)及血漿凝血酶原時間(PT)的影響 (x±SD)

4 討論

黃酮類化合物是植物在長期的自然選擇中產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物[18]。本試驗采用70%乙醇浸提，大孔樹脂純化方法得到總黃酮，證實了馬蹄黃含有黃酮類化合物，但是并未對馬蹄黃總黃酮最佳提取條件(如溫度、料液比、提取次數(shù)和時間等)進行分析，對馬蹄黃總黃酮的化學(xué)成分組成及結(jié)構(gòu)還需要進一步研究。

截至目前，關(guān)于馬蹄黃鮮有報道且缺少其藥理作用研究資料。因此，本試驗對馬蹄黃總黃酮抗炎、鎮(zhèn)痛、止血作用進行初步探討。通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗、角叉萊膠致小鼠足跖腫脹試驗建立動物急性非特異炎癥模型[19]。試驗結(jié)果表明，馬蹄黃總黃酮能抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹以及角叉萊膠致小鼠足跖腫脹且高劑量組效果顯著，對耳腫抑制率為57.89%，略高于余行報道的大葉紫珠高劑量總黃酮對二甲苯所致小鼠耳腫抑制率(49.35%)[20]。此外，本試驗結(jié)果表明，馬蹄黃總黃酮對急性炎癥具有明顯的抑制作用且具有一定的劑量依賴效應(yīng)，為臨床應(yīng)用馬蹄黃總黃酮治療急性非特異性炎癥等疾病提供了試驗資料。小鼠熱板法和醋酸扭體模型是藥理試驗檢測鎮(zhèn)痛藥物藥效最常用的方法，而此次鎮(zhèn)痛試驗結(jié)果顯示，馬蹄黃總黃酮3個劑量組均能延長小鼠舔舐后足所需的時間，提高痛閾值以及減少小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。馬蹄黃總黃酮高劑量組在30 min處痛閾值達到峰值(44.55 s)，其扭體鎮(zhèn)痛率為28.04%，高于劉濤報道的沙地柏總黃酮高劑量組在60 min處的痛閾值的峰值(29.28 s)[21]，但低于陳素報道的龍血竭總黃酮高劑量組的扭體鎮(zhèn)痛率(37.93%)[22]，兩者可能由于給藥劑量、給藥時間的不同以及小鼠、植物本身存在差異而導(dǎo)致結(jié)果不同?？寡缀玩?zhèn)痛試驗結(jié)果表明，它能有效緩解由化學(xué)或物理刺激引起的諸多炎性癥狀，并有助于提高痛閾和緩解致痛因素所帶來的疼痛感且效果顯著。在止血試驗中，通過測定小鼠斷尾出血時間以及對PT、TT時間的影響來判定馬蹄黃總黃酮的止血作用。試驗結(jié)果表明，馬蹄黃總黃酮低、中、高劑量組均可縮短小鼠出血時間和PT、TT時間，其中中、高劑量組可顯著縮短出血時間和PT時間，但對TT時間的影響不明顯，推測其可能原因與TT試劑未預(yù)熱至37 ℃有關(guān)，從而影響了本試驗結(jié)果。其馬蹄黃總黃酮高劑量組的小鼠斷尾法出血時間(9.47 min)略低于封燁報道的紫地榆提取物高劑量組的出血時間(13.67 min)，且效果略優(yōu)于陽性(云南白藥組)，提示馬蹄黃總黃酮具有一定的止血作用且呈劑量依賴效應(yīng)。

綜上所述，馬蹄黃總黃酮具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛、止血作用，但其抗炎、鎮(zhèn)痛、止血機制尚不明確，還需做進一步的研究和探討。