鎮(zhèn)江地區(qū)副豬嗜血桿菌分離鑒定血清型及耐藥性檢測(cè)

朱孟玲 ， 劉慶新 ， 孫智遠(yuǎn) ， 徐云明 ， 章 琰 ， 王永娟

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 江蘇 鎮(zhèn)江 212000 ；2. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 ， 江蘇 泰州 225300)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps)是臨床中豬呼吸道常見(jiàn)的一種革蘭陰性菌，該菌的形態(tài)具有多形性，主要侵害4～8周齡仔豬，臨床中主要表現(xiàn)為纖維素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎及腦膜炎等多種癥狀，其仔豬的發(fā)病率為10%～15%以上，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%[1-3]。研究表明，Hps在英國(guó)、澳大利亞、美國(guó)等多個(gè)國(guó)家及我國(guó)的黑龍江省、遼寧省、山東省、河南省等多個(gè)地區(qū)普遍流行，該病與豬藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒等病毒病混合感染，在我國(guó)其感染造成的損失相當(dāng)嚴(yán)重，該病已經(jīng)成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要細(xì)菌病之一[4]。Hps具有15個(gè)血清型， 20%左右的分離菌株未能鑒定出血清型，不同的地區(qū)流行的血清型不同，商品化疫苗難以對(duì)各種血清型Hps提供完全交叉保護(hù)[5-6]。Hps的防治主要依靠抗菌藥物，但由于長(zhǎng)期不合理使用，導(dǎo)致Hps對(duì)臨床中常用抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，降低其治療效果[7-8]。

本試驗(yàn)從鎮(zhèn)江地區(qū)85份患病豬的病料組織中分離得到了48株副豬嗜血桿菌，對(duì)分離的48株副豬嗜血桿菌分離菌株進(jìn)行血清型分布及耐藥性檢測(cè)，為該地區(qū)副豬嗜血桿菌的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 2019年3-6月，采集鎮(zhèn)江地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)中患病仔豬的肺臟、肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織85份。

1.2 主要試劑與儀器 巧克力培養(yǎng)基、7%綿羊血培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆固體培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，均購(gòu)自青島高科園海博技術(shù)有限公司；生化微量管,購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；200 mL無(wú)支原體胎牛血清,購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；氧化型輔酶1(NAD),購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；2×TaqMarker Mix,購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DL-2 000 Marker,購(gòu)自北京中科瑞泰生物公司；細(xì)菌藥敏紙片，購(gòu)自溫州康泰生物科技有限公司。梯度PCR儀由美國(guó)ABI公司生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)由美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋，均由上海恒一科技有限公司生產(chǎn)；常規(guī)的試劑與儀器由本實(shí)驗(yàn)提供。

1.3 分離與鑒定 將采集的患病仔豬的肺臟、肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織進(jìn)行處理后，接種于7%綿羊血培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18-24 h，挑取單個(gè)菌落分別接種在TSA 培養(yǎng)基和巧克力培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24-36 h，挑取單個(gè)菌落在TSB 進(jìn)行純化培養(yǎng)，進(jìn)行革蘭染色鏡檢觀察其形態(tài)。

1.4 生化鑒定試驗(yàn) 取純化分離菌株，按照說(shuō)明書(shū)接種于生化試劑管中，對(duì)分離菌株進(jìn)行生化鑒定。

1.5 分離菌株的PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[4]合成Hps特異性鑒定引物。P1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGT-3′，P2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，目的基因片段840 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，以提取的DNA為模板，用Hps特異性鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定，其分離菌株的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄參考株進(jìn)行同源性比較。

1.6 分離菌株的血清型鑒定 參考文獻(xiàn)[9]，合成 14 個(gè) Hps 血清型基因引物funB、wzx、glyC、wciP、wcwK、gltI、funQ、scdA、funV、funX、amtA、gltP、funAB和funI，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR反應(yīng)體系50 μL：2×TaqMarker 25 μL，引物P1、P2各2 μL，DNA模板2 μL，去離子水19 μL。94 ℃預(yù)變性 5 min; 94 ℃變性 30 s, 58 ℃復(fù)性30 s, 68 ℃延伸 60 s，30個(gè)循環(huán);最后68 ℃延伸5 min。將擴(kuò)增后的 PCR 產(chǎn)物于 1%瓊脂糖上凝膠電泳，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相記錄。

1.7 分離菌株的藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行，按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進(jìn)行結(jié)果判斷與耐藥性分析。取純化培養(yǎng)的分離菌株，調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋鶆蛲坎加赥SA，貼上藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)18-24 h，測(cè)量抑菌圈直徑(mm)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 疑似副豬嗜血桿菌在7%綿羊血培養(yǎng)基圓形的、邊緣整齊的、灰白色菌落；在TSA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出濕潤(rùn)的、光滑的、邊緣整齊的、灰白色的菌落；在巧克力培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形的、隆起的、表面光滑的、整齊的、灰白半透明的菌落。革蘭染色鏡檢結(jié)果，分離菌株為短桿狀、球狀、桿狀等多形性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，48株分離菌株與報(bào)道的副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)一致。

2.2 分離菌株生化鑒定結(jié)果 分離菌株均能分解果糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和阿拉伯糖；不分解甘露醇；吲哚試驗(yàn)為陰性；接觸酶試驗(yàn)為陽(yáng)性；脲酶、氧化酶、鳥(niǎo)氨酸脫氫酶均為陰性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)48株分離菌株的生化特性與報(bào)道的副豬嗜血桿菌生化特性基本相符。

2.3 細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果 用副豬嗜血桿菌特異性鑒定引物對(duì)分離的48株分離菌株均擴(kuò)增出大約為840 bp大小的目的基因(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示：分離的48株菌株的測(cè)序結(jié)果與GenBank庫(kù)中登錄的10株副豬嗜血桿菌參考株基因序列的同源性在97.9%～99.9%之間。說(shuō)明分離的48株分離菌為副豬嗜血桿菌。

圖1 分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果

2.4 血清型鑒定結(jié)果 分離的48株副豬嗜血桿菌用血清型基因引物擴(kuò)增出7種血清型目的條帶(圖2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，血清5型和12型為該地區(qū)副豬嗜血桿菌流行的主要優(yōu)勢(shì)血清型，分別占分離菌株的25.0%和31.3%(表1)。

圖2 分離菌株血清型PCR鑒定結(jié)果

表1 血清型檢測(cè)結(jié)果

2.5 耐藥性結(jié)果 由表2可知，分離的48株副豬嗜血桿菌對(duì)磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、慶大霉素、青霉素4種藥物耐藥性最高，耐藥率在81.3%～100.0%之間；對(duì)氨芐西林、大觀霉素、多粘菌素、多西環(huán)素、氟苯尼考5種藥物耐藥率在50.0%～79.2%之間；對(duì)頭孢噻呋、頭孢曲松、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素5種藥物耐藥率相對(duì)較低，耐藥率在12.5%～25.0%之間。

表2 副豬嗜血桿菌耐藥性分析結(jié)果

3 討論

副豬嗜血桿菌是臨床中常見(jiàn)的危害養(yǎng)豬業(yè)的主要病原菌之一，該菌對(duì)仔豬危害較低，發(fā)病率10%～15%，但死亡率高達(dá)50%以上，Hps屬于條件致病菌，當(dāng)外界環(huán)境改變或感染其他病原菌時(shí)，導(dǎo)致豬的抵抗力降低，可以誘導(dǎo)該病的發(fā)生與流行[8-10]。Hps主要通過(guò)空氣、直接接觸及排泄物等多種途徑傳播，該菌主要引起豬肺臟疾病，除直接引起患豬死亡外，還可以導(dǎo)致豬生長(zhǎng)性能降低、繼發(fā)多種病原感染，從而使肉品質(zhì)下降，引起食品安全問(wèn)題[5-7]。因此，在養(yǎng)殖過(guò)程中要注意該病的防控，同時(shí)也要注意環(huán)境的消毒。本試驗(yàn)從鎮(zhèn)江地區(qū)采集86份病料組織分離得到了48株副豬嗜血桿菌，說(shuō)明副豬嗜血桿菌在該地區(qū)正在流行，應(yīng)該引起重視。

目前報(bào)道Hps具有15個(gè)血清型，其中20%的臨床分離菌株不能成功分型。本試驗(yàn)表明，分離的48株Hps具有7種血清型，其中以血清5型和12型為該地區(qū)副豬嗜血桿菌流行的主要優(yōu)勢(shì)血清型，分別占分離菌株的25.0%和31.3%，可以將血清5型和12型作為研制滅活苗的候選菌株之一。蔡旭旺等[11]報(bào)道了我國(guó)副豬嗜血桿菌分離菌株以血清4型和5型為主要流行的血清型，其次是13型、14型和12型。于江等[12]報(bào)道了副豬嗜血桿分離菌株血清1型在我國(guó)也較為流行。說(shuō)明了副豬嗜血桿分離菌株的血清型的流行情況可能因地區(qū)不同存在一定的差異性，因此，該菌的疫苗研制存在一定困難。

由于目前沒(méi)有有效疫苗用于預(yù)防副豬嗜血桿菌，抗生素成為防治該病的主要手段之一，不合理的使用，不僅導(dǎo)致副豬嗜血桿菌產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，同時(shí)還降低治療效果[13]。本試驗(yàn)表明，分離的48株副豬嗜血桿菌對(duì)磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、慶大霉素等9種藥物耐藥率在50.0%～100.0%之間，對(duì)其他藥物耐藥率在12.5%～25.0%之間。因而說(shuō)明該區(qū)分離的副豬嗜血桿菌耐藥嚴(yán)重，可能與臨床不合理使用抗菌藥物有關(guān)，也可能由于副豬嗜血桿菌的耐藥機(jī)制發(fā)生改變引起耐藥性。因此，在發(fā)生該病時(shí)應(yīng)該合理使用抗菌藥物，減少耐藥性產(chǎn)生，提高治療效果。