鹿茸多肽對(duì)不同誘導(dǎo)劑致人肝細(xì)胞系L-02氧化損傷的保護(hù)作用

張宸豪 ， 駱曉峰 ， 李明光 ， 李 瑤 ， 李正祎

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院 , 吉林 吉林 132013 )

肝損傷是肝臟常見的病理損害,同時(shí)也是導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝癌的重要原因之一。肝損傷過程與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過度氧化，干擾細(xì)胞能量代謝,并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1-2]。乙醇、四氯化碳和過氧化氫在肝細(xì)胞內(nèi)的代謝可以增加細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子損傷和細(xì)胞死亡[3]，因此它們是體外建立肝損傷模型的常用誘導(dǎo)劑。鹿茸多肽(Velvet Antler Polypeptide，VAP)是雄性梅花鹿茸中提取的最具活性的小分子蛋白,我們以前的研究證明鹿茸多肽具有促進(jìn)肝細(xì)胞再生、抑制四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的藥理作用[4-6]。本試驗(yàn)以乙醇、四氯化碳和過氧化氫為誘導(dǎo)劑，建立體外肝損傷模型，觀察VAP對(duì)L-02細(xì)胞損傷后的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 L-02細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；鹿茸多肽，吉林大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng)；DMEM高糖培養(yǎng)液，購(gòu)自Gibco 公司；胎牛血清，購(gòu)自Hyclone公司；MTT，購(gòu)自Sigma公司；DMSO，購(gòu)自天津科邁歐化學(xué)試劑有限公司；Hoechst 33342，購(gòu)自Sigma公司；羅丹明123，購(gòu)自Amresco公司；四氯化碳，購(gòu)自天健凱通化學(xué)試劑有限公司；30%H2O2，購(gòu)自天健達(dá)茂化學(xué)試劑公司 。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 L-02細(xì)胞復(fù)蘇后在含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液、5%CO2、飽和濕度、37 ℃ 條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。試驗(yàn)分為模型組(Model)、VAP治療組(VAP)和空白對(duì)照組(Control)。模型組分別用不同濃度(0、0.5%、1%、3%、6%、12%)乙醇，不同濃度(0、2.5 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM)的四氯化碳和不同濃度(0、0.25 mM、0.50 mM、1 mM、2 mM、4 mM)的過氧化氫作用在L-02細(xì)胞上。根據(jù)IC50數(shù)值選取6%乙醇、20 mM四氯化碳和1mM過氧化氫作用于L-02細(xì)胞[7-8]。VAP治療組分為低VAPL，中VAPM和高VAPH三組，濃度分別為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.6 mg/mL。對(duì)照組僅給予DMEM高糖培養(yǎng)液，無藥物作用。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-02細(xì)胞，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后按上述組別給予藥物處理細(xì)胞，每個(gè)處理因素設(shè)3個(gè)復(fù)孔。 培養(yǎng)24 h后，向細(xì)胞中加入20 μL MTT(5mg / mL)。繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)。震蕩5 min后，在570 nm處測(cè)量吸光度(A)值。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=處理組平均A值/ 對(duì)照組平均A值×100%。

1.4 Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Hoechst 33342與凋亡細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)合后發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，與正常細(xì)胞區(qū)別。取5×105個(gè)細(xì)胞/孔的L-02細(xì)胞接種于24孔板中，按上述組別處理細(xì)胞12 h后更換含有不同濃度的VAP，作用24 h后PBS洗3次。 加入新鮮制備的4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。用PBS洗滌后，加入Hoechst33342(10 μg/mL)避光孵育15 min。PBS洗滌后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡。每組隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，用Image J軟件計(jì)算每張圖片(相同放大倍數(shù)下)總細(xì)胞數(shù)和Hoechst 陽性細(xì)胞數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，取細(xì)胞凋亡百分率均數(shù)值。

1.5 線粒體膜電位測(cè)定 羅丹明123(Rhodamine 123，Rh123)是一種可被線粒體吸收的熒光染料，其吸收值隨細(xì)胞線粒體膜電位(Mitochondria membrane potential，MMP)的改變而呈相應(yīng)的變化，從而改變細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。因此，可通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rh123 熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞MMP的變化。取5×105個(gè)細(xì)胞/孔的L-02細(xì)胞接種于24孔板中，按上述組別處理細(xì)胞12 h后更換含有不同濃度的VAP，作用24 h后PBS洗3次。取羅丹明123 染液(0.1 μg/mL)作用細(xì)胞避光孵育30 min，PBS沖洗后熒光顯微鏡下觀察攝片。隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，用Image J軟件分析圖片的熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)重復(fù)3次，取累計(jì)光密度均數(shù)值。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測(cè) 將5×105個(gè)細(xì)胞/孔L-02細(xì)胞接種到24孔板中，處理12 h后更換含有不同濃度的VAP，作用24 h后用PBS洗滌3次。H2DCFDA(10μM)加入到細(xì)胞中繼續(xù)避光孵育30 min。用PBS洗滌后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。試驗(yàn)重復(fù)3次，取累計(jì)光密度均數(shù)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用t檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 VAP可以抑制L-02細(xì)胞的損傷 不同濃度乙醇、四氯化碳和過氧化氫能顯著抑制L-02細(xì)胞生長(zhǎng)(圖1)。與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞存活率下降明顯；而治療組與模型組相比能顯著提高乙醇、四氯化碳和過氧化氫引起的細(xì)胞存活率下降，并且呈劑量依賴性方式增加(圖2)。

2.2 VAP對(duì)不同誘導(dǎo)劑作用L-02細(xì)胞凋亡的影響 6%乙醇、20 mM四氯化碳和1 mM過氧化氫能顯著改變L-02細(xì)胞的核形態(tài)，核凝集，增加細(xì)胞凋亡百分率，與空白對(duì)照組相比差異顯著。治療組與模型組相比能顯著抑制L-02細(xì)胞核的凝集，減少細(xì)胞核形態(tài)變化，降低了凋亡百分率。

圖3 VAP對(duì)受損L-02細(xì)胞凋亡的影響

2.3 VAP對(duì)不同誘導(dǎo)劑作用L-02細(xì)胞MMP的影響 6% 乙醇、20 mM四氯化碳和1 mM過氧化氫可引起的L-02細(xì)胞MMP顯著下降，細(xì)胞內(nèi)Rh123熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照組相比明顯降低。而治療組與模型組相比則能顯著地抑制6%乙醇、20 mM四氯化碳1 mM過氧化氫引起的MMP下降，增加了Rh 123的熒光強(qiáng)度(封二彩版圖4)。

圖4 VAP對(duì)受損L-02細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響

圖1 乙醇、四氯化碳和過氧化氫對(duì)L-02細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖2 VAP對(duì)L-02細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

2.4 VAP對(duì)不同誘導(dǎo)劑作用L-02細(xì)胞ROS的影響 用6% 乙醇，20 mM四氯化碳和1 mM過氧化氫處理L-02細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照組相比顯著增加。而治療組可降低細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(封二彩版圖5)。

圖5 VAP對(duì)受損L-02細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

3 討論

氧化應(yīng)激是肝損傷的關(guān)鍵因素，而ROS在肝損傷的氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。乙醇在肝細(xì)胞中乙醇脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為乙醛，使NAD+轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型NADH，NADH / NAD+的比例增加，從而抑制了脂肪酸β的氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂肪的積累。在乙醇代謝過程中，超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥基自由基等ROS水平升高，對(duì)蛋白質(zhì)、核酸等大分子造成破壞[9-10]；四氯化碳通過傷害肝細(xì)胞膜脂質(zhì)代謝細(xì)胞色素P450·CCl3等自由基，引起肝細(xì)胞凋亡[11-12]；H2O2是一種常見的氧自由基，通過脂質(zhì)過氧化作用誘導(dǎo)細(xì)胞膜損傷[13],低濃度下即可對(duì)L-02細(xì)胞造成較強(qiáng)損傷。因此，乙醇，四氯化碳是體內(nèi)和體外建立酒精性肝病，化學(xué)性肝損傷模型的理想誘導(dǎo)劑。至于過氧化氫，它可以模擬各種肝臟損傷的氧化應(yīng)激。研究表明，VAP不僅可以抑制四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，還可以抑制四氯化碳誘導(dǎo)的氧化作用。此外，VAP可以降低肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化[14]。另外，鹿茸中含有多種生長(zhǎng)因子以及近年來發(fā)現(xiàn)的活性多肽單體[15]，它們具有促進(jìn)傷口愈合和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。因此，VAP對(duì)L-02細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制乙醇，四氯化碳，過氧化氫對(duì)L-02細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)。

本試驗(yàn)證實(shí),VAP能顯著抑制乙醇，四氯化碳，過氧化氫對(duì)L-02細(xì)胞的損傷，提高L-02細(xì)胞的體外存活率。Hoechst 33342染色證實(shí),VAP可抑制L-02 細(xì)胞核的凝集和減少細(xì)胞核形態(tài)改變。 Rh123染色證實(shí)VAP可抑制L-02細(xì)胞損傷引起的膜電位變化。VAP降低了L-02細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，提高了SOD和GSH的水平。VAP對(duì)L-02細(xì)胞的保護(hù)作用與VAP的抗氧化能力有關(guān)。但是，VAP對(duì)L-02細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。