非洲豬瘟病毒國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

原 霖 , 楊 林 , 辛盛鵬 , 宋曉暉 , 董 浩 , 劉 洋 , 韓 燾 ,高旭年 , 李爾華 , 鐘鳳然 , 陳亞娜 , 王傳彬

(1.中國動物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京 大興 102618 ； 2.廣州邦德盛生物科技有限公司 ， 廣東 廣州 510000)

世界衛(wèi)生組織(WHO)于1997年發(fā)布了第一個核酸國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-丙型肝炎核酸國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，到目前為止已發(fā)布同類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)16種[1]。我國的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制起步較晚，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺可查詢到的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也主要是涉及微生物及轉(zhuǎn)基因植物等領(lǐng)域。相比其他領(lǐng)域，我國獸醫(yī)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究更是較為滯后，目前獸醫(yī)領(lǐng)域的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)只有2018年由中國動物疫病預(yù)防控制中心研制的豬繁殖與呼吸綜合征歐洲株(PRRSV LV)、豬繁殖與呼吸綜合征美洲變異株(PRRSV JXA1)、豬繁殖與呼吸綜合征美洲經(jīng)典株(PRRSV VR2332)3種核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。近年來獸醫(yī)領(lǐng)域的研究者們也對研制動物病原核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行了相關(guān)探索，主要為禽流感、新城疫和亞洲I型口蹄疫病毒等方面[2-4]，但這些研究成果未經(jīng)過國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)委員會的評審，未形成有證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度傳染性疾病。該病病程短，死亡率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害甚大，有著重要的社會經(jīng)濟學(xué)意義，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病之一，我國將其列為一類動物疫病[5]。2018年8月3日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布我國首例非洲豬瘟疫情。截止2019年8月非洲豬瘟進入中國1年，我國所有省份均有疫情發(fā)生，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部共發(fā)布疫情152起，累積撲殺生豬100余萬頭。目前非洲豬瘟無有效疫苗，唯一的防控手段只能加強養(yǎng)殖場生物安全和進行早期診斷檢測。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也要求生豬生產(chǎn)環(huán)節(jié)、調(diào)運環(huán)節(jié)和屠宰環(huán)節(jié)都需對非洲豬瘟病毒進行檢測，并聯(lián)合市場監(jiān)管總局和工業(yè)和信息化部聯(lián)合下文要求豬肉制品加工企業(yè)也開展非洲豬瘟病毒檢測。在《OIE陸生動物診斷與疫苗手冊》中，熒光定量PCR是檢測非洲豬瘟病毒的推薦方法，然而目前并沒有非洲豬瘟病毒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使得無法對各實驗室的非洲豬瘟病毒的檢測能力以及商品化非洲豬瘟檢測試劑進行有效的評價。

1 材料

1.1 主要試劑 E.Z.N.A.?Plasmid Mini Kit和OMEGA Gel Extraction Kit，購自O(shè)MEGA公司；QuantStudioTM3D Digital PCR 20K Chip Kitv2 and Master Mix，購自thermo公司；One-Step RT-ddPCR Kit for Probes，購自伯樂公司；引物探針由英濰捷基有限公司合成。

1.2 主要儀器 KINGFISHER DUO自動化核酸提取儀，QX200 Droplet Generator、QX200 Droplet Reader、QX200微滴式數(shù)字PCR儀，QuantStudio 3D Digital PCR System芯片式數(shù)字PCR儀，普通PCR儀，ABI 7500實時熒光定量PCR儀器。

2 方法

2.1 pUC19-P72質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中上傳的ASFV的P72基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了含分別BamH I和EcoR I酶切位點的擴增P72基因全長序列的特異性引物(ASFV 上游引物5′-CGGGATCCTTAGGTACTGTAACGCAGCA-3′和ASFV 下游引物5′-CGGAATTCATGGCATCAGGAGGAGCT-3′)。

對感染ASFV的病死豬病料組織研磨液進行核酸提取和PCR擴增?；厥誔CR擴增產(chǎn)物并進行雙酶切。將經(jīng)過BamH I和EcoR I雙酶切的擴增產(chǎn)物與同樣經(jīng)過雙酶切的pUC19載體進行連接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。對轉(zhuǎn)化獲得的克隆進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，并送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進行測序。

2.2 pUC19-P72質(zhì)粒的提取 將經(jīng)過測序驗證的陽性克隆，接入 10 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)12-14 h。按OMEGA公司“E.Z.N.A.?Plasmid Mini Kit”試劑盒的操作說明書進行質(zhì)粒的提取。

2.3 pUC19-P72質(zhì)粒的純度分析 按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34796-2017規(guī)定，以及《分子克隆》有關(guān)試驗要求，采用紫外分光光度法對質(zhì)粒的純度進行考察。純的DNA的A260/A280應(yīng)大于1.8，而A260/A230應(yīng)該達到2.0。

2.4 均勻性評估 隨機抽取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)30管樣本，每管樣本檢測3次。采用數(shù)字PCR方法進行檢測。使用單因素方差分析方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行均勻性評估。

2.5 穩(wěn)定性評估 為了評估標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，分別進行了長期穩(wěn)定性評估和短期穩(wěn)定性評估。

2.5.1 長期穩(wěn)定性評估 進行長期穩(wěn)定性評估的抽樣方法為：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃的儲存條件下，在第1，2，4，6，9，12個月抽取5管非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個樣品檢測2次。使用數(shù)字PCR方法進行檢測，計算平均值。使用回歸方法對非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行長期穩(wěn)定性評估。

2.5.2 短期穩(wěn)定性評估 進行短期穩(wěn)定性評估的抽樣方法可為：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4 ℃、25 ℃、37 ℃環(huán)境下存放30 d、15 d、9 d。抽取3瓶的非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個樣品檢測1次。使用數(shù)字PCR方法進行檢測。使用回歸方法對非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行短期穩(wěn)定性評估。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值 非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過多個實驗室合作定值方式進行定值。委托9家實驗室，采用數(shù)字PCR方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值進行測量。定值數(shù)據(jù)進行組內(nèi)可疑值檢驗、組間數(shù)據(jù)等精度檢驗剔除可疑值。當(dāng)各組數(shù)據(jù)等精度時，用t檢驗方法檢驗各組數(shù)據(jù)平均值是否有顯著性差異。如平均值無顯著性差異，先合并數(shù)據(jù)，檢驗數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性，在符合正態(tài)分布的情況下，可將多個平均值再次計算平均值，求出總平均值，即為標(biāo)準(zhǔn)值。

2.7 不確定度的評定 對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來說，其定值結(jié)果的不確定度由3部分組成，分別為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引入的不確定度ubb，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引入的不確定度us以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程引入的不確定度uchar。定值過程引入的不確定度分為不確定度的A類評定uA和不確定度的B類評定uB。不確定度A類評定通過測量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計學(xué)計算方法進行；不確定度的B類評定是借助可利用的相關(guān)信息，進行科學(xué)的分析判斷得到B類不確定度。將定值不確定度與均勻性評估、穩(wěn)定性評估引入的不確定度按照平方和開方的方法疊加就給出合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uCRM，該合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k得出的不確定度稱為擴展不確定度UCRM。

2.8 定值結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果表示為標(biāo)準(zhǔn)值±擴展不確定度。

2.9 臨床試用 25家試用單位在檢測日常臨床樣本時，將試用的非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行熒光定量PCR或者數(shù)字PCR檢測，一次檢測2管標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每管重復(fù)檢測3次，利用試用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對日常臨床樣品進行標(biāo)定。嚴(yán)格按照產(chǎn)品的說明書對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、臨床樣本進行標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR或者數(shù)字PCR定量檢測。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)粒pUC19-P72的構(gòu)建 對感染ASFV的病死豬病料組織研磨液進行核酸提取，并使用非洲豬瘟病毒P72基因全長序列擴增引物進行PCR擴增，獲得ASFV的P72基因全序列。PCR產(chǎn)物擴增結(jié)果如圖1所示。將擴增產(chǎn)物經(jīng)過BamH I和EcoR I雙酶切后，連接入pUC19載體。經(jīng)過PCR鑒定、酶切鑒定和測序證明載體pUC19-P72構(gòu)建成功，酶切結(jié)果如圖2所示。公司測序結(jié)果顯示，插入的P72基因序列長度為1 941個堿基，與我國非洲豬瘟病毒分離株ASFV-SY18同源性100%。

圖1 PCR產(chǎn)物擴增結(jié)果

圖2 pUC19-P72質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

3.2 質(zhì)粒pUC19-P72的純度分析 對提取的pUC19-P72質(zhì)粒的純度和濃度進行了4次重復(fù)測定，結(jié)果顯示，pUC19-P72質(zhì)粒的A260/280值均在1.9左右，A260/230值均大于2，質(zhì)粒濃度的均值為179.75 ng/μL，說明質(zhì)粒的純度良好，滿足實際使用要求。

3.3 均勻性檢測結(jié)果 統(tǒng)計隨機抽取的30管樣品，進行的90次檢測數(shù)據(jù)。根據(jù)自由度(v1,v2)及給定的顯著性水平α，可由表查臨界值的F值，算得F

表1 均勻性檢測結(jié)果

3.4 穩(wěn)定性檢測結(jié)果

3.4.1 長期穩(wěn)定性評估結(jié)果 長期穩(wěn)定性評估則是測試標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在長期儲存條件下(-20 ℃)的穩(wěn)定性，分別在第1，2，4，6，9，12個月對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行穩(wěn)定性評估。結(jié)果與分析：對非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的-20 ℃貯存條件下穩(wěn)定性結(jié)果進行分析，|β1|

表2 長期穩(wěn)定性結(jié)果

3.4.2 短期穩(wěn)定性評估結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4 ℃、25 ℃、37 ℃環(huán)境下存放30 d、15 d、9 d分別進行了回歸分析，|β1|

表3 短期穩(wěn)定性結(jié)果

3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果 委托9家實驗室采用數(shù)字PCR方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值進行測量，非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為5.78×103拷貝/μL。

3.6 不確定度的評定

3.6.1 均勻性引入的不確定度 均勻性引入的不確定度包括試劑盒的精密度，儀器的精密度和人員操作所引入的不確定度，為A類不確定度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sbb為1.12×102拷貝/μL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelbb=2.1%

3.6.2 穩(wěn)定性引入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度也涵蓋了儲存溫度的變動性對標(biāo)物的影響、試劑盒穩(wěn)定性引入的不確定度和人員操作引入的不確定度，為A類不確定度。暫定產(chǎn)品有效期為12個月，則有效期t=12個月的穩(wěn)定性不確定度貢獻為：s(β1)=14.1拷貝/μL；us=1.7×102拷貝/μL；相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urels=3.1%。

3.6.3 定值過程引入的不確定度 由定值測量重復(fù)性引入的不確定度u(A)由測量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計算。u(A)=3.17E+02拷貝/μL；相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)=5.5%。

不確定度的B類評定是根據(jù)有關(guān)的信息或經(jīng)驗，判斷被測量的可能值區(qū)間，假設(shè)被測量值的概率分布，根據(jù)概率分布和要求的概率確定B類不確定度為2.0%。

3.6.4 標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度評定 合成上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度分量，取擴展因子k=2，計算擴展不確定度。非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴展不確定度：UCRM=2×4.16 E+02=8.32E+02拷貝/μL。

3.7 定值結(jié)果的表示 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果表示為(5.8±0.9)×103拷貝/μL。

3.8 試用結(jié)果 委托25家獸醫(yī)檢測實驗室對非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行了試用，試驗結(jié)果表明該產(chǎn)品均一性良好、量值的準(zhǔn)確度高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，與動物樣本的互通性良好。

3.9 評審結(jié)論 制備的非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)滿足了國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，通過全國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會的評審。

4 討論

豬感染非洲豬瘟病毒后抗體產(chǎn)生的時間較晚，通常在感染7-9 d后才能血清出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)，而在感染48 h后就能檢測到非洲豬瘟病毒核酸的存在。因此，在非洲豬瘟病毒的檢測方法中，與其他檢測方法相比，核酸擴增技術(shù)更為方便、快捷和準(zhǔn)確，對于非洲豬瘟的早期診斷意義重大。除此之外，由于核酸擴增技術(shù)具有較高的特異性和敏感性，不僅可以檢測豬的唾液、血清、血漿、組織、細(xì)胞培養(yǎng)物，還可以對環(huán)境樣品、排泄物、飼料、食品等多種類型樣品進行檢測[6-7]，使得核酸檢測的應(yīng)用范圍更加廣泛。根據(jù)中國動物疫病預(yù)防控制中心公布的第2次非洲豬瘟現(xiàn)場快速檢測試劑評價名單，通過專家評審的34種非洲豬瘟檢測試劑盒全部為采用核酸擴增技術(shù)的產(chǎn)品，其中熒光定量PCR類28種，等溫擴增類6種[8]。

鑒于非洲豬瘟病毒感染豬的特性以及當(dāng)前我國非洲豬瘟流行和檢測的現(xiàn)狀，迫切需要一種非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，從而滿足養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、流通環(huán)節(jié)、屠宰環(huán)節(jié)非洲豬瘟病毒診斷的使用需求。因此本研究中研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按照《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》(JJF1343-2012)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行了均勻性和穩(wěn)定性評估。均勻性評估分別對樣品內(nèi)和樣品間進行了檢測，穩(wěn)定性評估分別對-20 ℃、4 ℃、25 ℃和37 ℃的保存效果進行了評估，結(jié)果顯示，本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性都能夠滿足相關(guān)要求。通過多家實驗室的臨床試用，該產(chǎn)品均一性良好、量值的準(zhǔn)確度高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，與動物樣本的互通性良好。綜上所述，本研究制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過評價滿足了國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，最終通過了全國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會的評審。

本試驗中研發(fā)的非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于檢測非洲豬瘟病毒的實驗室校準(zhǔn)、建立計量溯源性、為其他材料賦值、測量方法/程序的確認(rèn)，實驗室內(nèi)或?qū)嶒炇议g質(zhì)量控制量值傳遞、評價和控制測試方法、實驗室質(zhì)量控制等用途。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的成功研制為促進非洲豬瘟病毒的核酸檢測水平的提高，為保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和非洲豬瘟凈化提供了有效的工具，具有重大的經(jīng)濟效益和社會效益。