北京地區(qū)規(guī)模化奶牛場(chǎng)副結(jié)核流行病學(xué)調(diào)查

陳豐偉 , 曹 杰 , 馬 翀 , 張 巽

(1.海南農(nóng)墾草畜產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司 ， 海南 澄邁 571900 ; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ，北京 海淀 100193 ; 3.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 ， 北京 豐臺(tái) 100071)

奶牛副結(jié)核(Johne′s Disease，JD)，是一種慢性肉芽腫胃腸道疾病，其致病菌為副結(jié)核分支桿菌(MycobacteriumaviumsubspeciesParatuberculosis，MAP)。牛只在感染MAP后，通常經(jīng)過(guò)1年以上的潛伏期后，會(huì)表現(xiàn)出臨床癥狀，主要癥狀包括腹瀉、體重迅速減輕、產(chǎn)奶量下降等。感染奶牛的體況評(píng)分最后會(huì)達(dá)到1分甚至更低，并最終因失去生產(chǎn)能力而被淘汰。感染牛在發(fā)病腹瀉過(guò)程中會(huì)將大量MAP排入環(huán)境，威脅易感牛群。2001年，加拿大的JD陽(yáng)性牛場(chǎng)平均場(chǎng)內(nèi)陽(yáng)性率達(dá)到8.5%[1]，2005年澳大利亞全國(guó)奶牛的MAP血清抗體陽(yáng)性率達(dá)到19%[2]。環(huán)境保護(hù)、飼養(yǎng)隔離工作不到位等原因，造成了MAP的高感染率[3]。2013年有學(xué)者報(bào)道美國(guó)91.1%的奶牛場(chǎng)存在JD牛[4]。由于當(dāng)前國(guó)際上缺乏針對(duì)JD的特效藥物和可用疫苗，各國(guó)都采取JD控制計(jì)劃逐漸降低感染率。

本試驗(yàn)對(duì)北京地區(qū)7個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查，目的是為了確定這些牛場(chǎng)的場(chǎng)間血清抗體陽(yáng)性率以及場(chǎng)內(nèi)血清抗體陽(yáng)性率，以各場(chǎng)的MAP血清抗體陽(yáng)性率為基礎(chǔ)，為后續(xù)控制計(jì)劃的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象 本試驗(yàn)收集的樣品采集于2014年9-10月，選擇北京地區(qū)7個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)(>500頭存欄)。尾靜脈采血，分離血清0.5 mL，-20 ℃冰箱凍存?zhèn)錂z。為保護(hù)奶牛場(chǎng)的個(gè)體隱私，在此僅進(jìn)行場(chǎng)間陽(yáng)性率對(duì)比分析，并在結(jié)果中取消區(qū)域性特征的描述。

1.2 試驗(yàn)材料 MAP抗體ELISA試劑盒(IDEXX公司)，2 mL注射器，離心管，96孔PCR板(用于儲(chǔ)存血清樣品)，96孔空白孵育板，移液槍，槍頭，熱電Wellwash 4MK2型洗板機(jī)以及酶標(biāo)儀(ThermoFisher公司)，去離子水。

1.3 試驗(yàn)方法 采用MAP抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(IDEXX公司)進(jìn)行檢測(cè)血清中的IgG。檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，將可疑牛視為陰性。統(tǒng)計(jì)場(chǎng)間陽(yáng)性率，場(chǎng)內(nèi)陽(yáng)性率，牛只陽(yáng)性率，以及陽(yáng)性牛月齡分布等。

2 結(jié)果

去除掉信息不齊全和重復(fù)的樣品后，最終總計(jì)采集8 549頭牛的血清樣品。

2.1 個(gè)體牛MAP血清抗體陽(yáng)性率 7個(gè)牧場(chǎng)共檢測(cè)8 549頭牛，MAP血清抗體陽(yáng)性牛數(shù)共791頭，個(gè)體牛MAP血清抗體陽(yáng)性率達(dá)到9.25%(表1)。血清抗體陽(yáng)性牛主要集中在成母牛，犢牛和育成牛的血清抗體陽(yáng)性率均低于1%。因此以后進(jìn)行JD控制計(jì)劃時(shí)，可以不采集小于等于12月齡牛的樣品。

表1 各養(yǎng)殖階段MAP血清抗體陽(yáng)性率

2.2 各場(chǎng)MAP血清抗體陽(yáng)性率 7個(gè)牛場(chǎng)的場(chǎng)間MAP血清抗體陽(yáng)性率達(dá)到100%(7/7)，場(chǎng)內(nèi)MAP血清抗體陽(yáng)性率為5.08%～12.62%(表2)。其中2號(hào)場(chǎng)、4號(hào)場(chǎng)、6號(hào)場(chǎng)抗體陽(yáng)性率均大于10%。表明MAP感染普遍存在，不同牛場(chǎng)感染情況存在差異。

表2 各場(chǎng)MAP血清抗體陽(yáng)性率

2.3 不同月齡牛MAP血清抗體陽(yáng)性率 按照6個(gè)月為一個(gè)區(qū)間進(jìn)行劃分，對(duì)不同月齡區(qū)間牛MAP血清抗體陽(yáng)性率分析。結(jié)果顯示，各月齡區(qū)間均存在血清抗體陽(yáng)性牛，且主要集中在25-96月齡范圍內(nèi)(圖1)。24月齡以下的各個(gè)區(qū)間陽(yáng)性率均低于4%，并呈現(xiàn)隨月齡上升的趨勢(shì)。24月齡以下共計(jì)檢測(cè)牛3 441頭，其中血清抗體陽(yáng)性牛僅56頭，陽(yáng)性率為1.63%。25-96月齡范圍內(nèi)各個(gè)區(qū)間的陽(yáng)性率均大于10%，在該月齡范圍內(nèi)共計(jì)檢測(cè)牛4 872頭，其中陽(yáng)性牛712頭，陽(yáng)性率為14.61%。96月齡以上的各個(gè)區(qū)間陽(yáng)性率有所起伏：97-102月齡區(qū)間陽(yáng)性率小于4%；103-108月齡和109-114月齡區(qū)間陽(yáng)性率分別為8.33%和8.16%；115月齡以后的陽(yáng)性率均大于12%。本次96月齡以上共計(jì)檢測(cè)牛236頭，其中血清抗體陽(yáng)性牛23頭，陽(yáng)性率為9.75%。

2.4 MAP血清抗體陽(yáng)性牛S/P值分布情況 S/P值(Sample to positive value)反映了MAP抗體的滴度。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為樣品S/P≥0.55，即0.55為判定界限值(Cut-off)。Michael認(rèn)為可以根據(jù)S/P值進(jìn)行感染程度的分級(jí)[5-6],在此我們針對(duì)7個(gè)場(chǎng)陽(yáng)性牛的S/P值進(jìn)行分級(jí)分析。

結(jié)果顯示，在MAP血清抗體陽(yáng)性牛中，強(qiáng)陽(yáng)性牛占12.52%，中等陽(yáng)性牛占55.50%，弱陽(yáng)性牛占31.98%(表3)。使用R語(yǔ)言進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，MAP血清抗體陽(yáng)性牛的S/P值不呈現(xiàn)正態(tài)分布(圖2)。對(duì)S/P值使用GLM分析發(fā)現(xiàn)，不同月齡的陽(yáng)性牛，其S/P值存在極顯著差異(P<0.01)。進(jìn)一步Duncan檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，月齡高的陽(yáng)性牛S/P顯著大于月齡低的陽(yáng)性牛S/P(表4)。

圖1 各月齡區(qū)間MAP血清抗體陽(yáng)性率

表3 MAP血清抗體陽(yáng)性牛S/P值 (n=791)

圖2 MAP血清抗體陽(yáng)性牛S/P值正態(tài)性檢驗(yàn)圖

表4 7場(chǎng)血清抗體陽(yáng)性牛S/P月齡區(qū)間的Duncan檢驗(yàn) (n=791)

3 討論

JD作為一種慢性腸道疾病，較難做到早期診斷和防控，其臨床病程較為復(fù)雜，感染牛只可向環(huán)境中排菌，對(duì)易感牛群構(gòu)成威脅。國(guó)內(nèi)外近年報(bào)道全球JD牛檢出率一直保持上升趨勢(shì)。JD牛進(jìn)入臨床期后，會(huì)表現(xiàn)腹瀉、產(chǎn)奶量降低等癥狀，導(dǎo)致牛群淘汰率升高，同時(shí)影響全群牛型結(jié)核的檢疫結(jié)果。不僅影響牛場(chǎng)生產(chǎn)收入，也浪費(fèi)了大量的飼料、人工費(fèi)用。2008年因JD牛問(wèn)題，美國(guó)牛場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)2.5億美元。

本次JD流行病學(xué)調(diào)查在北京市不同區(qū)縣的7個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)開(kāi)展。結(jié)果顯示，場(chǎng)間血清抗體陽(yáng)性率達(dá)到100%(7/7)，場(chǎng)內(nèi)血清抗體陽(yáng)性率為5.08%～12.62%，個(gè)體牛血清抗體陽(yáng)性率為9.25%。上述結(jié)果表明，JD是北京乃至整個(gè)華北地區(qū)牛場(chǎng)的普遍性問(wèn)題(考慮北京防疫工作)，且感染牛群基數(shù)較大，提示JD已經(jīng)存在于各個(gè)牧場(chǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。其原因主要是此前國(guó)內(nèi)牛場(chǎng)并未關(guān)注JD，牛只腹瀉未經(jīng)過(guò)系統(tǒng)診斷，直接采用抗生素輸液治療，因此感染牛逐漸增多并發(fā)展到如今的狀態(tài)。這些牛場(chǎng)均需要開(kāi)展JD控制計(jì)劃，同時(shí)應(yīng)當(dāng)注意避免向其他牛場(chǎng)輸出MAP血清抗體陽(yáng)性牛。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，犢牛和育成牛的MAP血清抗體陽(yáng)性率分別為0.43%和0.49%，青年牛的陽(yáng)性率達(dá)到2.47%。感染了MAP的犢牛和育成牛，機(jī)體主要是以細(xì)胞免疫為主，此階段進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)的敏感性低。表明感染牛通常在12月齡以后表現(xiàn)MAP血清抗體陽(yáng)性?？紤]到采樣難度和血清抗體陽(yáng)性檢出率不同階段差異的特點(diǎn)，對(duì)于實(shí)施JD控制計(jì)劃的牛場(chǎng)，我們建議僅對(duì)大于12月齡牛群采集血樣。

犢牛作為MAP最易感群體，是JD控制計(jì)劃的最重要環(huán)節(jié)。牛場(chǎng)應(yīng)當(dāng)針對(duì)犢牛管理和產(chǎn)房管理進(jìn)行調(diào)整，確實(shí)切斷各種可能的傳播途徑。

本試驗(yàn)中，24-96月齡范圍內(nèi)的奶牛的陽(yáng)性率較高(14.61%)，與犢牛期間感染MAP，并在24月齡以后表現(xiàn)抗體陽(yáng)性的感染特點(diǎn)相吻合。24月齡以上奶牛作為控制計(jì)劃的主要對(duì)象，牛場(chǎng)要對(duì)血清抗體陽(yáng)性牛進(jìn)行標(biāo)記，并棄用初乳，若出現(xiàn)臨床癥狀應(yīng)立即淘汰。96月齡以上各區(qū)間血清抗體陽(yáng)性率波動(dòng)較大，可能與樣本數(shù)量有關(guān)，因?yàn)楦啐g牛通常無(wú)法達(dá)到生產(chǎn)要求或者因?yàn)楦黝惣膊?、流產(chǎn)已經(jīng)淘汰。同時(shí)高齡牛因?yàn)槊庖吣芰Φ南陆?，其更容易感染MAP。對(duì)于這類牛只尤其是有臨床癥狀的建議盡早淘汰。Nielsen S S[7]等人關(guān)于奶牛的MAP排菌狀態(tài)的研究，提示感染牛一般在24月齡后開(kāi)始以體液免疫應(yīng)答，與本試驗(yàn)結(jié)果基本吻合，而關(guān)于感染狀態(tài)和排菌情況之間關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

IDEXX公司生產(chǎn)的MAP抗體ELSIA試劑盒,其檢測(cè)原理是以包被MAP特異性抗原為基礎(chǔ)的間接ELISA試驗(yàn)，最終通過(guò)終止反應(yīng)體系的光密度(OD值)來(lái)獲得樣品中的抗體滴度。此試劑盒的特異性為99.42%[8]，敏感性為45%[9]。由于不同批次試驗(yàn)的差異，該試劑盒對(duì)此進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，即通過(guò)計(jì)算獲得S/P值(樣品陽(yáng)性比率)，其計(jì)算公式為：S/P=(樣品OD值-陰性對(duì)照OD值)/(平均陽(yáng)性對(duì)照OD值-陰性對(duì)照OD值)。根據(jù)公式可知在消除批次差異的同時(shí)，S/P與樣品OD值、抗體滴度，呈正向線性關(guān)系。我們對(duì)791頭血清抗體陽(yáng)性牛進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，月齡越高，S/P值越高。這說(shuō)明了牛只感染MAP的時(shí)間越長(zhǎng)，其病程階段更嚴(yán)重，對(duì)環(huán)境的污染和牛群的健康更加不利。本試驗(yàn)基于S/P值分級(jí)，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性牛(S/P≥2)占12.52%(99/791)。Michael等人建議，對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性牛停止配種工作以防止其進(jìn)入下一個(gè)泌乳期。對(duì)于中等陽(yáng)性和弱陽(yáng)性牛，牛場(chǎng)應(yīng)當(dāng)做好經(jīng)濟(jì)效益與牛群健康關(guān)系的權(quán)衡，一旦這些牛只出現(xiàn)臨床癥狀應(yīng)立即淘汰[6]。

上述7個(gè)牛場(chǎng)，在近年的牛型結(jié)核皮試檢疫工作中，曾出現(xiàn)大量假陽(yáng)性牛。例如2號(hào)奶牛場(chǎng)曾經(jīng)在一次牛型結(jié)核檢疫中出現(xiàn)皮試陽(yáng)性和可疑牛共計(jì)600頭，但是經(jīng)過(guò)牛型結(jié)核IFN-γ試驗(yàn)篩查后僅1頭為陽(yáng)性。本試驗(yàn)認(rèn)為，JD會(huì)干擾牛型結(jié)核檢疫結(jié)果，其干擾率有待進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

綜上所述，北京規(guī)模化奶牛場(chǎng)MAP感染情況不容樂(lè)觀，為有效控制感染率，以及避免感染對(duì)牛場(chǎng)生產(chǎn)帶來(lái)的負(fù)面影響，建議陽(yáng)性牛場(chǎng)開(kāi)展JD控制計(jì)劃。