奶牛隱性乳房炎中致病性大腸桿菌luxS及pfs基因表達(dá)及AI-2體外合成

曹素芳 ， 王金合 ， 皇甫和平 ， 康 宇 ， 陳奎榮 ， 陳淑慧 ， 張 凡 ， 趙雯娟 ， 楊永磊

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046)

致病性大腸桿菌能夠引起奶牛乳房炎、犢牛腹瀉等疾病的病原。其中大腸桿菌是引起奶牛乳房炎主要病原菌之一，對(duì)奶牛業(yè)危害較大，每年造成的直接或間接經(jīng)濟(jì)損失較大。目前，大腸桿菌引起奶牛乳房炎的致病機(jī)制仍未十分明確，與單個(gè)游離狀態(tài)的大腸桿菌不同，引起奶牛乳房炎的大腸桿菌來自于環(huán)境[1]，只有當(dāng)環(huán)境中的存在大量致病性大腸桿菌時(shí)，才容易通過乳頭孔進(jìn)入奶牛乳房中導(dǎo)致炎癥，但環(huán)境中的致病性大腸桿菌是通過什么機(jī)制進(jìn)入奶牛乳房中引起乳房炎，目前還不十分清楚。有研究表明，細(xì)菌感染動(dòng)物導(dǎo)致疾病與細(xì)菌的密度感應(yīng)(Quorum sensing，QS)系統(tǒng)有關(guān)，QS又稱細(xì)菌的群體感應(yīng)，是細(xì)菌間通過產(chǎn)生和交換可擴(kuò)散信號(hào)分子進(jìn)行信息交流，以協(xié)調(diào)群體行為的過程[2]。QS是保護(hù)細(xì)菌適應(yīng)復(fù)雜外界環(huán)境的重要機(jī)制。在QS系統(tǒng)中，信號(hào)分子是細(xì)菌間傳遞信息的關(guān)鍵，它可通過QS在細(xì)菌之間進(jìn)行信息傳遞，導(dǎo)致特定基因的表達(dá)[3]。研究顯示，大多數(shù)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有QS系統(tǒng)，其中重要的QS為L(zhǎng)xuS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)于哈維弧菌。Mukesh K.Yadav等[4]研究表明，LxuS/AI-2系統(tǒng)決定豬鏈球菌對(duì)宿主的感染能力。Fang-Fang Jia等[5]研究發(fā)現(xiàn)，LxuS蛋白在乳桿菌的抗逆性和粘附性方面起著關(guān)鍵作用。Xiaoka Wu等[6]研究顯示，催化合成AI-2蛋白的pst基因在禽致病性大腸桿菌感染宿主中至關(guān)重要。盡管有許多證據(jù)表明，LxuS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)在細(xì)菌的致病性具有重要作用，但該系統(tǒng)在致病性大腸桿菌引起奶牛隱性乳房炎過程中的調(diào)控機(jī)制還未見報(bào)道，為了探索奶牛隱性乳房炎中致病性大腸桿菌中的LxuS/AI-2的調(diào)控機(jī)制，本試驗(yàn)通過對(duì)奶牛隱性乳房炎中的致病性大腸桿菌E285的luxS基因和pfs基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及純化，獲得E285的重組LuxS蛋白和Pfs蛋白，將獲得的重組LuxS蛋白和Pfs蛋白體外催化SAH(S-adenosyl homocysteine，SAH)合成AI-2信號(hào)分子，為進(jìn)一步深入研究AI-2信號(hào)分子對(duì)奶牛致病性大腸桿菌的毒力基因表達(dá)、生物被膜形成、毒素合成等的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 奶牛隱性乳房炎中致病性大腸桿菌E285為本實(shí)驗(yàn)室分離保存的；大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；宿主菌BL21(DE3)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 主要試劑 MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit、ExTaq酶、EcoRI、HindIII、DNase、蛋白Marker，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；羊抗兔IgG(IgG-HRP)，購(gòu)自Abcam@公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pET-30a(+)為韓先干博士惠贈(zèng)；質(zhì)粒提取試劑盒、NC膜，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；IPTG，購(gòu)自Sigma公司。His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中發(fā)表的luxS(YP-001199965)和pfs(NC-009443)基因序列，分別設(shè)計(jì)并合成luxS和pfs基因的特異性引物，luxS基因引物：luxS-F: 5′-CCGGAATTCATG CCGTTGTTAGATA GCTT-3′,luxS-R:5′-CCCAAGCTTCTAGATGTGCAGTTCCTG-3′;pfs基因引物：pfs-F：5′-CCGGAATTCATGAAAATCGGCATCATTGGTG-3′,pfs-R：5′-CCCAAGCTTTTA GCCATGTGCAAGTTTCTG-3′。上游引物加有EcoRI酶切位點(diǎn)(下劃線)，下游引物加有HindIII酶切位點(diǎn)(下劃線)。

1.2.2 E285的luxS及pfs基因PCR擴(kuò)增 取凍存的奶牛隱性乳房炎中致病性大腸桿菌E285培養(yǎng)過夜，提取細(xì)菌DNA，以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行l(wèi)uxS基因及pfs基因擴(kuò)增。

在25 μL體系中加入10×ExTaqBuffer 2.5 μL,4dNTP 1 μL,luxS基因或pfs基因上下游引物各0.5 μL，細(xì)菌DNA 1 μL，ddH2O 19 μL，5 U/μL ExTaq酶0.5 μL，混勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將獲得的PCR產(chǎn)物luxS片段、pfs片段及表達(dá)載體pET-30a(+)分別用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切，回收后，分別插入pET-30a(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑取疑似菌落于含Kan+的LB液體中，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、酶切鑒定及序列測(cè)定。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-luxS和pET-pfs分別轉(zhuǎn)化BL21中，挑取單個(gè)菌落接種于含50 μg/mL Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.001 mol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)6 h，取誘導(dǎo)表達(dá)的菌液1.5 mL，12 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀加入適量的ddH2O進(jìn)行重懸，超聲破碎，離心收集上清進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.5 重組蛋白純化 將重組pET-luxS表達(dá)菌及pET-pfs表達(dá)菌分別進(jìn)行大量培養(yǎng)，按1.2.4進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，加入60 mL超聲裂解緩沖液，混勻，再加入終濃度為50 μg/ mL的DNase，混勻，室溫作用30 min。進(jìn)行超聲裂解，4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，收集上清和沉淀，按His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書純化，將收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.6 多克隆抗體制備 取純化的重組LuxS蛋白和Pfs蛋白各1 mg，按1∶1與弗氏完全佐劑進(jìn)行混合乳化。分別皮下免疫2只新西蘭大白兔，每只免疫1 mL。一免后再免疫2次，間隔均為2周，劑量相同。三免后2周心臟采血分離血清，56 ℃滅活，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 Western Blot 檢測(cè) 將收獲的表達(dá)上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上，NC膜用10%脫脂乳封閉過夜，加入多克隆抗體室溫作用2 h，PBST 洗滌3次，每次10 min,再加入HRP-羊抗兔IgG作用1 h,用PBST洗滌3次后進(jìn)行顯色，觀察結(jié)果。

1.2.8 體外合成AI-2及活性檢測(cè) 分別取1 mg/mL純化的重組蛋白LuxS和Pfs，加入含SAH(1 mmol/L)的磷酸鈉緩沖液中，37 ℃反應(yīng)1 h后用Millpore超濾膜過濾，測(cè)定濾液中AI-2蛋白的濃度，濾液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將哈維弧菌BB170接種于新鮮的AB培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)過夜，菌液按1∶5 000稀釋后，分別體外合成的AI-2、陽(yáng)性對(duì)照BB152培養(yǎng)上清和陰性對(duì)照DH5α培養(yǎng)上清，30 ℃培養(yǎng)5 h，用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)物的發(fā)光情況。每組重復(fù)4個(gè)孔。

2 結(jié)果

2.1luxS基因和pfs基因的PCR擴(kuò)增 以特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增luxS基因和pfs基因，結(jié)果顯示，擴(kuò)增到的條帶分別約為516 bp和690 bp，與目的條帶大小一致(圖1)。表明PCR擴(kuò)增到了目的片段。

圖1 luxS基因和pfs基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

2.2.1 PCR及酶切鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定結(jié)果顯示，2個(gè)重組質(zhì)粒均能擴(kuò)增到和目的片段大小相同的片段(圖2A)。重組質(zhì)粒pET-luxS分別用EcoRI、HindIII單酶切，均獲得了1條約5 938 bp條帶，與重組質(zhì)粒大小一致；用EcoRI和HindIII雙酶切得到1條約5 422 bp和1條516 bp兩條帶，小帶與目的基因luxS基因大小相同；pET-pfs分別用EcoRI、HindIII單酶切，均獲得了一條約6 112 bp條帶，與重組質(zhì)粒大小一致，用EcoRI和HindIII雙酶切得到1條約5 422 bp和1條690 bp兩條帶，小帶與目的基因pfs基因大小相同(圖2B、C)。PCR和酶切鑒定均證明重組質(zhì)粒pET-luxS和pET-pfs構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定A：重組質(zhì)粒pET-luxS 和pET-pfs PCR鑒定; B:重組質(zhì)粒pET-pfs酶切鑒定； M：DL-2 000； 1：EcoR I+Hind III酶切； 2：EcoR I酶切； 3：Hind III酶切； M1：EcoT14; C:重組質(zhì)粒 pET-luxS酶切鑒定; M1：EcoT14； 4: EcoR I酶切； 5:Hind III酶切； 6:EcoR I+Hind III酶切； M：DL-2 000

2.2.2luxS基因和pfs基因序列測(cè)定 將PCR鑒定和酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明,luxS基因和pfs基因均插入到載體pET-30a(+)中。本試驗(yàn)獲得的luxS基因大小為516個(gè)核苷酸，pfs基因?yàn)?90個(gè)核苷酸。將獲得的luxS基因核苷酸序列與IAI39 (NC_011750.1)、K-12 (NC_000913.3)、luxS(AJ786260.1)、UMN026(NC_ 011751.1)進(jìn)行同源性比較，結(jié)果同源性均達(dá)到98.6%以上，其推導(dǎo)的氨基酸與它們的同源性達(dá)到99%以上。將pfs基因核苷酸序列與大腸桿菌EC590的pfs基因核苷酸序列(CP016182.21)比較結(jié)果顯示，它們間的同源性也達(dá)到99.9%，只有181位核苷酸不同(圖略)，其氨基酸序列同源性為100%。

2.3 重組質(zhì)粒pET-luxS和pET-pfs表達(dá)純化 將含有重組質(zhì)粒pET30a-luxS和pET30a-pfs的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-luxS和pET-pfs經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，在24 kD和30 kD位置出現(xiàn)了較深的條帶，和目的蛋白LuxS和Pfs大小一致(圖3)，表明在luxS基因和Pfs基因在BL21中獲得了表達(dá)。重組質(zhì)粒pET-luxS和pET-pfs表達(dá)的上清經(jīng)過His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化(圖4)，經(jīng)蛋白測(cè)定儀測(cè)定表達(dá)的目的蛋白濃度分別為4.6 mg/mL和5.3 mg/mL。

2.4 Western Blot鑒定重組LuxS和Pfs蛋白 將表達(dá)純化的LuxS和Pfs蛋白免疫新西蘭大白兔獲得的多抗，通過Western Blot鑒定后，在相應(yīng)的位置出現(xiàn)了條帶(24 ku和30 ku)(圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖3 重組蛋白LuxS和Pfs的 SDS-PAGE

圖4 重組蛋白LuxS和Pfs Western Blot檢測(cè)及其純化產(chǎn)物的SDS-PAGE

2.5 信號(hào)分子AI-2的體外合成及活性檢測(cè) AI-2體外合成的結(jié)果表明 ，當(dāng)純化的重組蛋白LuxS和Pfs與SAH同時(shí)作用后，其反應(yīng)液經(jīng)過濾后，測(cè)定濾液中的AI-2蛋白濃度為200 μmol/L，運(yùn)用BB170可檢測(cè)其AI-2活性是陰性對(duì)照(DH5α) 的61倍(圖5) ，表明合成了具有生物學(xué)活性的AI-2。在AI-2的體外合成試驗(yàn)中，僅Lux S或Pfs單獨(dú)作用于底物SAH時(shí) ，其反應(yīng)產(chǎn)物沒有檢測(cè)到明顯的AI-2活性(圖5) ，表明AI-2的體外合成需要LuxS和Pfs的同時(shí)參與。

3 討論

研究表明，革蘭陰性菌中存在LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)[7-8]，該系統(tǒng)中AI-2信號(hào)分子是同種細(xì)菌、異種細(xì)菌之間進(jìn)行交流的“通用語(yǔ)言”，其合成需要兩種催化酶LuxS和Pfs的共同參與。目前，牛源大腸桿菌中AI-2信號(hào)分子研究不多，對(duì)其的調(diào)控機(jī)制也不十分清楚，本研究以AI-2的催化酶基因luxS、pfs為研究對(duì)象，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定后進(jìn)行序列測(cè)定及分析，結(jié)果表明，所獲得的luxS基因與GenBank中大腸桿菌中的已知序列高度同源，同源性達(dá)到99%以上，這與Surette等[9]的報(bào)道結(jié)果一致。說明luxS基因在細(xì)菌中高度保守。對(duì)獲得的pfs基因進(jìn)行序列分析也表明，其序列也相對(duì)保守。

圖5 應(yīng)用哈維弧菌BB170檢測(cè)體外合成的AI-2蛋白活性

本試驗(yàn)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pet30a- luxS和pet30a-pfs轉(zhuǎn)化入BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，結(jié)果表明,luxS基因和pfs基因均可在BL21中大量表達(dá)可溶性重組蛋白，與曹素芳等[10]研究結(jié)果一致。但與Chayen 等[11]研究結(jié)果不同。其原因可能是LuxS和Pfs與融合標(biāo)簽6×His結(jié)合后提高了重組蛋白的可溶性。

許多研究發(fā)現(xiàn)，所有生物如真核生物、放線菌、藍(lán)細(xì)菌等均存在SAH轉(zhuǎn)變?yōu)锳I-2分子循環(huán)途徑[8]，該循環(huán)過程需要LuxS和Pfs兩蛋白的催化作用。在本試驗(yàn)中，將純化的重組蛋白LuxS和Pfs按不同量(1 mg/mL：0.5 mg/mL;1 mg/mL：1 mg/mL;1 mg/mL：1.5 mg/mL;1 mg/mL：2 mg/mL)混合于含SAH的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)液中合成的AI-2蛋白質(zhì)含量測(cè)定及活性檢測(cè)結(jié)果顯示，重組蛋白LuxS和Pfs等量混合催化SAH獲得的AI-2蛋白含量最高(結(jié)果略)。本試驗(yàn)還同時(shí)進(jìn)行了重組蛋白LuxS或Pfs單獨(dú)催化底物SAH，檢測(cè)結(jié)果顯示，沒有獲得AI-2蛋白，所有試驗(yàn)結(jié)果均證明AI-2蛋白合成必需LuxS與Pfs共同催化SAH才能完成，二者缺一不可，與韓先干等[12]研究結(jié)果相符。Hyunjoon Park等研究表明，大腸桿菌O157:H7缺乏LuxS蛋白就無法合成AI-2，本試驗(yàn)的結(jié)果也與之一致。說明細(xì)菌中AI-2的合成是LuxS和Pfs蛋白催化SAH產(chǎn)生有活性作用的AI-2信號(hào)分子。本試驗(yàn)體外合成的AI-2蛋白將為后續(xù)進(jìn)一步研究該蛋白調(diào)控毒力基因的表達(dá)、生物被膜的形成及毒素的合成等提供物質(zhì)支持。