反膠束法提取小米中蛋白酶條件的優(yōu)化

付莉媛,代旭棟,張宇輝,付 俐,郭凱林,張弘弛,劉 瑞

(山西大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009)

小米中的營(yíng)養(yǎng)成分十分豐富，它不僅含有人體生長(zhǎng)不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且還擁有一定的藥用價(jià)值[1]。但目前人們對(duì)小米蛋白酶的提取研究較少，本實(shí)驗(yàn)采用反膠束提取法分離小米蛋白酶，旨在提高提取率，為后續(xù)對(duì)小米蛋白酶的研究提供參考。反膠束萃取法有著選擇性高、容易放大、萃取液可循環(huán)利用、分離和濃縮同步進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于酶蛋白的分離[2]。并且反膠團(tuán)可以保護(hù)酶蛋白分子，所以使用反膠束萃取可以有效減少提取過程有機(jī)溶劑對(duì)酶蛋白分子的損傷。而且反膠束萃取技術(shù)與傳統(tǒng)的酶蛋白提取技術(shù)相比，它成本更低并且可以進(jìn)行連續(xù)操作[3]。

1 材料

1.1 小米

小米,大同29號(hào)。

1.2 儀器與試劑

PHS-3C型pH計(jì)酸度計(jì)(上海儀電科技儀器股份有限公司)；XFB-200型小型粉碎機(jī)(吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠)；UV-3200S型紫外/可見分光光度計(jì)(上海美國(guó)譜達(dá)儀器有限公司)；AXTGL16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；JA5003B型千分之一電子天平(河南精密儀器儀表有限公司)。堿性蛋白酶(源葉生物，批號(hào)L19A6L1)；正辛烷、正己醇、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)；氯化鉀；氫氧化鈉；鹽酸；所有試劑均為分析純。

2 方法

2.1 提取小米蛋白酶

適量粉碎后的小米粉于燒杯，按料液比1∶10(質(zhì)量體積)加入蒸餾水，攪拌提取60 min。4000 r/min離心20 min，待離心完成后取上清液即小米蛋白酶粗提取液。

2.2 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

將堿性蛋白酶粉末用0.1 mol/L的KCl溶液(pH值標(biāo)定為11)分別配制成濃度為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L的酶溶液，然后以0.1 mol/L的KCl溶液(標(biāo)定pH值為11)為空白對(duì)照，使用紫外/可見分光光度計(jì)在258 nm處對(duì)所有濃度的堿性蛋白酶溶液進(jìn)行掃描，測(cè)量其吸光度值。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 CTAB濃度(A)對(duì)提取效果的影響

將正辛烷與正己醇按照4∶1的比例配置成混合液，然后取適量CTAB粉末，配置成濃度為0.01，0.015，0.02，0.025，0.03 mol/L的反膠束溶液。小米蛋白酶粗提取液用濃度為0.10 mol/L的氯化鉀溶液(pH值標(biāo)定為11)稀釋，得1.0 g/L小米蛋白酶溶液。然后酶溶液分別與上述不同CTAB濃度的反膠束溶液以1∶1的比例混合，并且振蕩混勻5 min，使得萃取相充分萃取。待振蕩結(jié)束后將濁液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，配平后3000 r/min離心4 min，然后取下相液，在258 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各樣品的吸光度值。

2.3.2 正辛烷與正己醇的配比(B)對(duì)提取效果的影響

將正辛烷與正己醇分別按照以下比例配置成混合液：3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1。取適量CTAB粉末，用不同配比的有機(jī)溶劑混合液分別配置成0.020 mol/L的反膠束溶液。小米蛋白酶溶液分別與有機(jī)溶劑配比不同的反膠束溶液以1∶1的體積比進(jìn)行混合，后續(xù)步驟同上。

2.3.3 氯化鉀溶液濃度(C)對(duì)提取效果的影響

用天平精確稱取適量氯化鉀晶體并用蒸餾水將其分別配置成濃度為0.05，0.075，0.10，0.125，0.15 mol/L的溶液(pH值標(biāo)定為11)，然后用上述不同濃度的氯化鉀溶液將小米蛋白酶粗提取液稀釋為1.0 g/L蛋白酶溶液。將反膠束溶液與氯化鉀濃度不同的小米蛋白酶溶液混合，并且振蕩混勻5 min，使得萃取相充分萃取。后續(xù)步驟同上。

2.3.4 小米蛋白酶溶液與反膠束相溶液的配比(D)對(duì)提取效果的影響

用天平精確稱取適量氯化鉀晶體并用蒸餾水配置成濃度為0.10 mol/L的氯化鉀溶液(pH值標(biāo)定為11)，并用其稀釋小米蛋白酶粗提取液，得到1.0g /L蛋白酶溶液。將反膠束相溶液與蛋白酶溶液分別按照不同的配比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)混合(混合液體積固定)，并且振蕩混勻5 min，使得萃取相充分萃取。后續(xù)步驟同上。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，然后進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，水平設(shè)置見表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 2 Orthogonal experimental designTable

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用origin軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，以及回歸方程為Y=1.66189x+0.03052，(R=0.99812)，其中x為濃度(g/L)，Y為吸光度值。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1 CTAB濃度對(duì)提取效果的影響

不同濃度的CTAB對(duì)提取小米蛋白酶的效果的影響見圖2，從圖2可以得知隨著CTAB的濃度逐漸升高，提取液在258 nm處的吸光度值也逐漸升高，當(dāng)吸光度值達(dá)到最大(1.913)時(shí)，CTAB的濃度為0.025 mol/L。當(dāng)濃度再增加時(shí)，吸光度迅速下降。當(dāng)CTAB濃度在一個(gè)比較低的范圍內(nèi)時(shí)，隨著CTAB濃度的增大，反膠束體系中反膠團(tuán)的形成也會(huì)增多，因而增溶酶蛋白的能力也會(huì)增強(qiáng)[4]。但是，CTAB的濃度不能太高，否則就會(huì)對(duì)酶蛋白的萃取效果造成不良影響。因?yàn)楹试谒囿w積不變的情況下，會(huì)隨著CTAB濃度的增大而減小，反膠團(tuán)的大小也隨之減小，當(dāng)反膠團(tuán)小于酶蛋白分子時(shí)，酶蛋白就不能進(jìn)入到反膠團(tuán)中[5]，因而當(dāng)濃度超過0.025 mol/L時(shí)，吸光度會(huì)下降。根據(jù)以上分析最終選取CTAB的濃度為0.025 mol/L。

圖2 CTAB濃度對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of CTAB concentration on extraction

圖3 正辛烷-正己醇對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of n-octane-n-hexyl alcohol on extraction

3.2.2 正辛烷與正己醇的配比對(duì)提取效果的影響

正辛烷與正己醇的不同配比對(duì)小米蛋白酶提取效果的影響見圖3，從圖3中可以看出當(dāng)正己醇的含量逐漸升高時(shí)吸光度也在逐漸升高，并且在比例為3.5∶1時(shí)達(dá)到最大(1.099)。但是，當(dāng)比例小于3.5∶1，即正己醇含量更加高時(shí)吸光度值迅速減小。正己醇能夠插入到CTAB分子之間，從而減弱CTAB分子之間的內(nèi)聚力，增大了其在有機(jī)溶劑中的溶解度，促進(jìn)了反膠束相的形成。但是，當(dāng)正己醇含量太高時(shí)，反膠團(tuán)表面上正己醇所占的比例過大，導(dǎo)致CTAB極性頭之間的靜電斥力減弱，反膠團(tuán)的尺寸減小，形成空間位阻，以致無(wú)法包裹酶蛋白分子，使得萃取效果減弱[6]。綜上結(jié)果選取正辛烷-正己醇混合液比例為3.5∶1。

3.2.3 氯化鉀溶液濃度對(duì)提取效果的影響

不同濃度的KCl溶液對(duì)小米蛋白酶提取效果的影響見圖4，從圖4中可以看出當(dāng)KCl濃度增至0.075 mol/L時(shí)吸光度值最大，為0.772。然后隨著KCl溶液的濃度逐漸增大，吸光度值慢慢減小，并且在0.15 mol/L時(shí)達(dá)到最小。當(dāng)鉀離子濃度增大后，鉀離子就會(huì)大量向“水池”移動(dòng)并且取代酶蛋白，使得酶蛋白分子從“水池”鹽析出來。鉀離子濃度增大，反膠團(tuán)內(nèi)表面的雙電層受到壓縮而變薄，使得酶蛋白與反膠團(tuán)內(nèi)表面之間的靜電吸引力減小，最終使萃取率降低。反膠團(tuán)內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減弱了CTAB之間的相互斥力，導(dǎo)致反膠團(tuán)的內(nèi)徑變小，從而使酶蛋白分子不能進(jìn)入反膠團(tuán)中[7]。所以吸光度值會(huì)隨著KCl濃度的增大而逐漸減小，綜上所訴最后選取KCl溶液的濃度為0.075 mol/L。

3.2.4 小米蛋白酶溶液與反膠束相溶液的配比對(duì)提取效果的影響

小米蛋白酶溶液與反膠束相溶液的比例對(duì)小米蛋白酶提取效果的影響見圖5，由圖5可知，隨著比例的增大吸光度值在逐漸的減小，而當(dāng)比例為1∶1時(shí)達(dá)到最小(1.038)，但是當(dāng)小米蛋白酶溶液與反膠束溶液的比例超過1∶1時(shí)，吸光度值就會(huì)隨著比例的增大而逐漸增大?；旌弦褐行∶椎鞍酌傅暮繒?huì)隨著小米蛋白酶溶液與萃取液配比的逐漸減小而減小。當(dāng)小米蛋白酶溶液與萃取液混合后的體積一定時(shí)，隨著配比的逐漸減小，混合液中萃取液所占的比例漸漸增大。雖然混合液中小米蛋白酶的含量降低，但是反膠團(tuán)的數(shù)量增多，所有反膠團(tuán)中含有的小米蛋白酶總量也增大[8]。所以吸光度值也在增大。終合考慮選擇小米蛋白酶溶液與萃取液的比例為1∶2。

圖4 KCl濃度對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of KCl concentration on extraction

圖5 小米蛋白酶溶液與萃取液的配比對(duì)提取效果的影響Fig.5 Effect of the ratio of protease solution and active solution on the extraction of millet

3.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，根據(jù)回歸方程計(jì)算出相應(yīng)的酶含量并填入表3對(duì)應(yīng)的空格內(nèi)。然后使用“spss”電腦軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，其中把極差最小的B項(xiàng)作為誤差項(xiàng)，主體間效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果見表4。根據(jù)表3的結(jié)果我們可以知道Rd﹥Rc﹥Ra﹥Rb，即四個(gè)因素對(duì)反膠束萃取的影響順序?yàn)樾∶椎鞍酌溉芤号c反膠束萃取液的比例﹥KCl濃度﹥CTAB濃度﹥正辛烷與正己醇的配比。根據(jù)表4中的方差分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)因素A、C的Sig值都大于0.05，因素D的Sig值小于0.05，所以因素D對(duì)小米蛋白酶的提取效果有顯著性影響，因素A、C對(duì)小米蛋白酶的提取效果均無(wú)顯著性影響。綜合上文的所有分析，確定小米蛋白酶的最佳提取條件為A2B1C2D3，即CT AB濃度為0.025 mol/L，正辛烷與正己醇比例為3∶1，KCl濃度為0.075 mol/L，小米蛋白酶溶液與反膠束溶液比例為1∶2。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的最佳結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并在258 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值，分別得到三個(gè)水平的結(jié)果為0.824 g/L，0.825 g/L，0.824 g/L，均值為0.8243 g/L，接近正交實(shí)驗(yàn)的最佳結(jié)果，所以可以確定小米蛋白酶的最佳提取條件為CTAB濃度為0.025 mol/L，正辛烷與正己醇比例為3∶1，氯化鉀濃度為0.075 mol/L，小米蛋白酶溶液與反膠束溶液比例為1∶2。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化小米蛋白酶的反膠束提取條件為目的，對(duì)四個(gè)不同的提取條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制成折線圖，直觀分析結(jié)果；然后以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，其中對(duì)四個(gè)單因素的三個(gè)水平分別設(shè)置為：CTAB濃度0.020 mol/L、0.025 mol/L、0.030 mol/L；正辛烷與正己醇比例3∶1、3.5∶1、4∶1；KCl濃度0.05 mol/L、0.075 mol/L、0.10 mol/L；小米蛋白酶溶液與反膠束溶液比例2∶1、1∶1、1∶2。最后對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析并得出最佳提取條件CTAB濃度為0.025 mol/L，正辛烷與正己醇比例為3∶1，氯化鉀濃度為0.075 mol/L，小米蛋白酶溶液與反膠束溶液比例為1∶2。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal experimental results