羅非魚魚鱗膠原蛋白的研究進(jìn)展

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(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品加工與安全研究所,四川雅安 625014)

羅非魚屬于熱帶性魚類,因其生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、耐低氧、產(chǎn)量高的特點(diǎn),且肉質(zhì)鮮美、骨刺少,含有人體所需的蛋白質(zhì)、礦物元素及氨基酸,具有較高的營養(yǎng)價值,全世界對羅非魚產(chǎn)品的消費(fèi)需求逐年上升。從1990年的100萬噸到2014的530.78萬噸[1],這說明羅非魚已成為最重要的養(yǎng)殖和貿(mào)易對象之一,被稱為“二十一世紀(jì)之魚”[2]。我國羅非魚產(chǎn)量居世界第一,據(jù)2016年的研究統(tǒng)計，我國每年羅非魚生產(chǎn)量約占世界的30%,且仍以每年9%的增速增加,出口量占國際72%,位居世界第一[3-5]。目前,國內(nèi)羅非魚產(chǎn)品以初加工產(chǎn)品為主。在加工過程中產(chǎn)生的大量下腳料,如魚皮、魚鱗、魚骨、魚鰓等,約占魚體總質(zhì)量的40%～55%,下腳料中約有10%左右的魚鱗資源被浪費(fèi)[6],如不妥善處理,不僅會污染環(huán)境,還會浪費(fèi)現(xiàn)有資源。

魚鱗中含有豐富的膠原蛋白,膠原蛋白分解的肽可直接被人體腸道吸收,長期食用可以增強(qiáng)皮膚組織細(xì)胞的儲水能力、提高皮膚彈性、修復(fù)損傷細(xì)胞、延緩衰老,同時也能強(qiáng)化體質(zhì)[7]。目前,由于產(chǎn)品質(zhì)量、宗教信仰和安全性等因素的影響,提取膠原蛋白的原材料逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗a(chǎn)生物[8]。如何提高魚鱗的廢物利用率、減少環(huán)境污染,同時生產(chǎn)出滿足人們需要的羅非魚魚鱗膠原蛋白、降低成本,成為目前亟待解決的問題。基于此,本文就羅非魚魚鱗膠原蛋白的組成、結(jié)構(gòu)、提取、性能及應(yīng)用進(jìn)行了綜述,以期為羅非魚魚鱗膠原蛋白深入研究與開發(fā)提供參考。

1 羅非魚魚鱗的結(jié)構(gòu)及組成

1.1 羅非魚魚鱗的結(jié)構(gòu)

不同種類魚的鱗片種類、數(shù)量及排列也不同。魚鱗大致包括盾鱗、硬鱗以及骨質(zhì)鱗,骨質(zhì)鱗又可分為圓鱗與櫛鱗。Ikoma等[9]在研究羅非魚魚鱗結(jié)構(gòu)時,選用傅里葉變換紅外光譜和X射線進(jìn)行分析,魚鱗主要由分布在其表面的羥基磷灰石及內(nèi)部緊密的膠原纖維構(gòu)成。電鏡掃描羅非魚魚鱗結(jié)構(gòu)圖見圖1。

圖1 掃描電鏡下的羅非魚魚鱗結(jié)構(gòu)圖[10]Fig.1 Tilapia fish scale structure under scanning electron microscope[10]

1.2 羅非魚魚鱗組成

有研究表明[6,11-12]:羅非魚魚鱗中含有蛋白質(zhì)(35%～55%)、水分(12%～19%)、灰分(25%～35%)和脂肪(0.5%～1%)等。羅非魚魚鱗中的膠原蛋白主要是Ⅰ型膠原蛋白(約30%),還包括部分角蛋白,灰分中最主要的元素是鈣。Huang等[13]首次利用擠壓法提取羅非魚魚鱗中的膠原蛋白,在高效提取的同時降低了膠原蛋白的魚腥味,采用SDS-PAGE對羅非魚魚鱗中膠原蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:羅非魚魚鱗樣品擁有兩條不同的α鏈以及和它們相交聯(lián)的β鏈,這兩種不同α亞基的存在表明魚鱗的主要膠原蛋白是I型膠原蛋白[14],三個樣品間膠原蛋白并無顯著差異。魚鱗表面的羧基磷灰石對膠原纖維上起保護(hù)支撐作用,但會降低膠原蛋白的提取率,直接對膠原蛋白進(jìn)行提取會降低其提取率與提取質(zhì)量[15]。一般情況下,羅非魚魚鱗膠原蛋白中的氨基酸包括組成人體(除色氨酸以外)的19種氨基酸,具體含量見表1。

表1 羅非魚魚鱗膠原蛋白氨基酸含量(%)[10,16-18]Table 1 Tilapia fish scale collagen amino acids(%)

由表1可知,當(dāng)用不同的方法分析羅非魚魚鱗中膠原蛋白的氨基酸組成時,氨基酸種類維持穩(wěn)定,且Gly、Ala、Hyp及Pro含量較高。宋芹等[16]使用酸解法測出膠原蛋白中含有Hyl,其他研究者在文獻(xiàn)中并未標(biāo)明數(shù)據(jù),可能是在實(shí)驗(yàn)時未進(jìn)行測定。表1給出的四篇文獻(xiàn)中,關(guān)于甘氨酸含量這一項(xiàng)存在較大差異,El-Rashidy所測數(shù)據(jù)較其他研究人員所測結(jié)果較低,可能是所用羅非魚的種類不同所引起的。

2 羅非魚魚鱗膠原蛋白的提取方法

膠原蛋白在食品、生物、醫(yī)學(xué)和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛,魚類蛋白的組成與人體最接近,是最容易被人體組織辨識、吸收的膠原蛋白來源。膠原蛋白的制備根據(jù)不同的原料采用的方法是多種多樣的。但總的來說,羅非魚魚鱗膠原蛋白的提取原理基本都是通過改變其存在環(huán)境,將其從多種蛋白中分離出來,再進(jìn)一步進(jìn)行純化,最終得到所需要的膠原蛋白。目前國內(nèi)羅非魚魚鱗膠原蛋白的開發(fā)及運(yùn)用較少,常采用的提取方法主要為酸提法、堿提法、熱提法及酶提取法。由于羅非魚魚鱗膠原蛋白中羥脯氨酸含量較低,且與變性溫度成正比,所以在羅非魚魚鱗膠原蛋白熱提取過程中溫度應(yīng)當(dāng)控制在0～30 ℃,否則三條肽鏈將完全解離,高溫下蛋白質(zhì)失活,提取率被降低[19]。

2.1 預(yù)處理

Mitsuhiro Okuda等[20]指出魚鱗膠原纖維層中的羥基鱗灰石起保護(hù)支撐作用,其中灰分可達(dá)34.2%,特別是鈣含量尤其高,達(dá)15.8%。吳蕾等[21]研究指出:磷灰石覆蓋在膠原蛋白表面會降低魚鱗膠原蛋白的提取率。因此,在提取前對魚鱗進(jìn)行脫鈣處理有助于獲得更多膠原蛋白。

目前常用的脫鈣方法包括EDTA脫鈣法和酸脫鈣法。Ilona等[22]比較兩種方法后得出:酸脫鈣法效率更高,但魚鱗膠原蛋白會因?yàn)樗岬拇嬖诙糠至魇АＴ倏萚18]在羅非魚魚鱗膠原蛋白的提取中發(fā)現(xiàn),將洗凈的魚鱗浸泡在1.03 mol/L的氯化鈉溶液中24 h,去除其他雜物質(zhì),再用0.2 mol/L的EDTA溶液浸泡4 h,即可完全脫鈣。張俊杰等[23]的研究表明,完成脫鈣處理后再在0.15 mol/L的NaCl溶液中浸泡一段時間,去除表面雜蛋白后，再根據(jù)不同方法進(jìn)行魚鱗膠原蛋白的提取。

2.2 常規(guī)提取法

2.2.1 酸提法 酸法提取是利用低濃度的酸破壞分子結(jié)構(gòu),引起膠原纖維的膨脹、溶解,從而獲取膠原蛋白。主要工藝流程為:魚鱗→洗凈→酸溶液溶解→離心→沉淀→收集上清液→純化→膠原蛋白。Caputo等[24]利用乙酸對魚鱗膠原蛋白進(jìn)行了提取,后續(xù)采用電泳及蛋白質(zhì)印跡法證明了酸提取法不會破壞天然膠原結(jié)構(gòu),因此提取的膠原蛋白純度較高。曾江南等[25]將等量魚鱗分別浸泡在0.5 mol/L的鹽酸、醋酸、檸檬酸、乳酸溶液中,經(jīng)過一段時間后測定膠原蛋白提取率,得到鹽酸提取率為7.55%,檸檬酸7.02%,乳酸6.23%,醋酸4.36%,這表明鹽酸提取率最高,檸檬酸次之,但由于膠原蛋白易受酸影響變性,故通常多采用較柔和的有機(jī)酸,如乙酸、檸檬酸、乳酸。在實(shí)驗(yàn)中,他們還用0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5 mol/L的檸檬酸對魚鱗進(jìn)行處理,測定膠原蛋白提取率,結(jié)果顯示魚鱗膠原蛋白的提取率與檸檬酸濃度呈正相關(guān),這說明高濃度的酸溶液可以有效地提高羥脯氨酸的得率,但酸溶液的濃度過高可能導(dǎo)致膠原蛋白變性,故應(yīng)根據(jù)樣品情況選擇較合適的酸濃度。除此之外,曾江南等[25]還對酸提取的時間進(jìn)行了探究,發(fā)現(xiàn)提取時間對于魚鱗膠原蛋白的提取率也有一定影響,魚鱗膠原蛋白的提取率隨時間的增加而提高,在0～24 h內(nèi)幾乎成正比例增長,超過24 h后增長趨勢不再明顯。

2.2.2 堿提法 堿法提取是指利用堿性溶液浸提膠原蛋白。羅非魚魚鱗膠原蛋白含有酸性基團(tuán)與堿性基團(tuán),在堿性環(huán)境中可以分別與堿、酸結(jié)合,造成膠原的肽鏈斷裂,膠原溶出。常用提取試劑為CaO、Ca(OH)2、Na2CO3等[10]。主要工藝流程:魚鱗→洗凈→堿性溶液溶解→離心→調(diào)pH→沉淀→離心→沉淀→除鹽→純化→膠原蛋白。Wang等[26]證明了堿可以提取出膠原蛋白,但由于堿是腐蝕性物質(zhì),所以制得的膠原蛋白結(jié)構(gòu)不夠完整?；诖?目前運(yùn)用堿法制取羅非魚魚鱗膠原蛋白的試驗(yàn)較少,多是用堿法制取明膠。

2.2.3 熱水提取法 熱水法提取,是將原材料浸泡在一定溫度的熱水中,再通過一系列提純工藝,最終獲得膠原蛋白(水溶性)的方法。主要工藝流程:魚鱗→洗凈→熱提取→離心→濃縮→干燥→膠原蛋白。康樂[27]通過研究羅非魚魚鱗膠原蛋白的制備,得到:在100 ℃下,提取1.5 h后可獲得20.2%的水溶性膠原蛋白。劉石生等[28]在熱水提取羅非魚魚鱗膠原蛋白的研究中證明了，在100 ℃熱水中雖然可以提取出魚鱗膠原蛋白,但由于耐熱性較差,所以制得的是結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生改變的膠原蛋白。

2.2.4 酶法提取法 酶法提取是指在一定環(huán)境條件利用不同的酶切斷肽鍵從而提取膠原蛋白。常用的酶包括:胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、無花果蛋白酶等。主要工藝流程:魚鱗→洗凈→烘干→酶解→提取液→離心→純化→膠原蛋白。Liu等[29]證明了運(yùn)用胃蛋白酶所提取的魚鱗膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)是完整的。曾健輝[30]在酶解羅非魚魚鱗制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的工藝研究中比較了魚鱗膠原蛋白在胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶中的水解情況,結(jié)果顯示堿性蛋白酶對魚鱗膠原蛋白的水解情況最好。張培等[31]的研究表明金槍魚內(nèi)臟中提取的酸性蛋白酶對羅非魚魚鱗膠原蛋白的提取率不如豬胃蛋白酶,這表明不同種類的酶對膠原蛋白的提取率是不一樣的。

2.2.5 常規(guī)方法的比較 綜合以上四種方法的優(yōu)缺點(diǎn),總結(jié)如下:

在羅非魚魚鱗膠原蛋白的提取中,酶法提取是目前最有效的提取工藝,故其是目前研究最多的方法,研究者們大多數(shù)從影響酶解效果的因素入手,主要包括有酶的種類、酶的使用量、酶解時間、酶解溫度、pH及料水比等。

2.3 聯(lián)合提取法

目前,在提取方法方面有研究人員提出將多種新方法來提高膠原蛋白提取率。張燕[32]在研究中發(fā)現(xiàn)將熱水法與酶解法相結(jié)合,提取率較之單一使用酶法提取高,可以從35.69%提升到65.51%。Huang等[13]提出了一種新型擠壓-加氫提取(EHE)工藝,將制得的羅非魚魚鱗粉末作為原料,并以4.7∶1 (w/v)的比例與重蒸水,pH=2的檸檬酸或乙酸混合作為預(yù)處理步驟,使用單螺桿擠出機(jī)進(jìn)行擠出蒸煮,在模頭端收集擠出物并在50 ℃的熱空氣烘箱中保持30 min以除去額外的水分,再將干燥并研磨成粉末后的羅非魚魚鱗擠出物(TFSE)浸泡在重蒸餾水中,樣品比為1∶10 (w/v),并在25 ℃或50 ℃的水浴中振蕩1 h,將混合物在10200×g離心10 min,收集上清液即得羅非魚魚鱗膠原蛋白溶液,該工藝可將膠原蛋白提取率提高2～3倍。宋芹等[33]研究得到多種酶結(jié)合提取膠原蛋白比單一酶提取膠原蛋白提取率高的結(jié)論。除此之外,超聲波輔助法在近年來也被較多的應(yīng)用在膠原蛋白提取中,胡楊等[34]用超聲波輔助對草魚鱗、沙丁魚鱗、鰱魚鱗的膠原蛋白提取進(jìn)行了優(yōu)化,證明了超聲波能輔助提取膠原蛋白從而提高提取率。張帥[35]在羅非魚皮膠原蛋白提取及性質(zhì)研究中指出，超聲波能夠輔助提取魚皮膠原蛋白,但目前超聲波輔助提取暫未被用于羅非魚魚鱗膠原蛋白的提取中。

3 羅非魚魚鱗膠原蛋白的性能

3.1 羅非魚魚鱗膠原蛋白的理化性質(zhì)

羅非魚魚鱗膠原蛋白為淡黃色黏性膠體,稍帶豆腥味。王春等[36]在研究中對比了膠原蛋白溶液和蒸餾水的水分殘留率,結(jié)果表明,隨著時間延長,水分殘留率均下降,但羅非魚魚鱗膠原蛋白溶液的水分殘留量比蒸餾水的高,說明魚鱗膠原蛋白有一定的保水性。葉忱[10]在羅非魚鱗膠原蛋白基抗菌凝膠的研究中得到:酸溶性魚鱗膠原蛋白的熱變性溫度在35.2 ℃左右,與羅非魚生活環(huán)境溫度大致相似,羅非魚魚鱗膠原蛋白的乳化性約為48.5%、乳化穩(wěn)定性約為59.9%、起泡性約為185.0%、起泡穩(wěn)定性良好。

3.2 羅非魚魚鱗膠原蛋白的抗氧化活性

羅非魚魚鱗膠原蛋白可以進(jìn)一步水解為膠原多肽,李靈等[37]在羅非魚魚鱗膠原多肽的優(yōu)化制備及其生物活性研究中表明,羅非魚魚鱗膠原蛋白多肽具有抗氧化活性,且其抗氧化能力隨羅非魚魚鱗膠原蛋白多肽的濃度增加而增加。Zhang等[38]利用復(fù)合酶法提取出膠原多肽,并得到其抗氧化性能與其所提取濃度成正比的結(jié)果,提取物中可能含有更易于羥基自由基獲得的肽,這是其具有抗氧化性能的原因。

3.3 羅非魚魚鱗膠原蛋白的毒理性

羅非魚魚鱗膠原蛋白雖無毒,但其因具有小清蛋白類似的結(jié)構(gòu),故具有過敏性。葉忱[10]在羅非魚鱗膠原蛋白基抗菌凝膠的研究中進(jìn)行的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,該實(shí)驗(yàn)所提取的酸溶性魚鱗膠原蛋白半致死量大于5000 mg/kg,根據(jù)毒理學(xué)中的毒性分級為無毒,但根據(jù)Hamada等[39]的研究表示膠原蛋白與魚類過敏原——小清蛋白結(jié)構(gòu)相似,也是一種過敏原,故在今后的研究中應(yīng)當(dāng)攻克過敏原問題。

4 羅非魚魚鱗膠原蛋白的應(yīng)用

4.1 羅非魚魚鱗膠原蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

近年來,膠原蛋白因其低免疫原性以及生物相容性等特性被廣泛運(yùn)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。涂宗財?shù)萚40]在酶解魚鱗蛋白制備抗氧化肽的研究中證明,魚鱗膠原蛋白具有抗氧化、延緩衰老、降低血壓、降膽固醇等功效。李鵬等[41]以羅非魚魚鱗膠原蛋白制作出了包埋抗壞血酸的微膠囊。黃煜[42]通過小鼠股動脈止血試驗(yàn)證明了,羅非魚魚鱗膠原蛋白與殼聚糖復(fù)合形成的止血海綿止血功能較醫(yī)用脫脂棉更優(yōu),且其安全性高,無過敏性,是一種優(yōu)質(zhì)的止血材料。羅非魚魚鱗膠原蛋白水解物可治療骨質(zhì)疏松與骨關(guān)節(jié)炎[4]。魚鱗膠原蛋白還被用于制成新型的心臟生物瓣膜,與傳統(tǒng)機(jī)械生物瓣膜相比,它可以擁有更長的使用壽命,使使用者疼痛感降低[9]。

4.2 羅非魚魚鱗膠原蛋白在化妝品中的應(yīng)用

有研究表明,生產(chǎn)出的魚鱗膠原蛋白應(yīng)用于護(hù)發(fā)產(chǎn)品中,能使頭發(fā)有光澤、順滑、易梳理,應(yīng)用于其他護(hù)膚類化妝品,比起從豬、牛中提取的傳統(tǒng)膠原蛋白更具有優(yōu)良的保濕性和光潔度[28]。

目前,并沒有明確指出將羅非魚魚鱗膠原蛋白應(yīng)用于化妝品研究的文獻(xiàn),但有研究顯示:膠原蛋白及其水解產(chǎn)物與人體自身膠原蛋白結(jié)構(gòu)相似,能較好的滲入皮膚,對皮膚起到保護(hù)、提高彈性、補(bǔ)充水分、延緩衰老的功效,與此同時,膠原蛋白及其水解產(chǎn)物還具有調(diào)節(jié)pH的作用,且作為穩(wěn)定劑、乳化劑能降低化妝品刺激物質(zhì)對皮膚的危害,是理想的護(hù)膚產(chǎn)品。但是化妝品中只有分子量低于2 kU的膠原蛋白分子才能被皮膚吸收,而從魚鱗中提取的大部分膠原蛋白分子都太大了[43]。因此,如何將魚鱗中所提取的膠原蛋白降解,使其達(dá)到人體皮膚所能吸收的大小是研究羅非魚魚鱗膠原蛋白工作中的重點(diǎn)。

4.3 羅非魚魚鱗膠原蛋白在食品中的應(yīng)用

羅非魚魚鱗中營養(yǎng)豐富,特別是含有魚鱗膠原蛋白及不飽和脂肪酸,有預(yù)防心血管疾病、抗衰老等功效,故常作為主料或輔料開發(fā)保健類產(chǎn)品。如傳統(tǒng)保健食品阿膠、膠原蛋白飲料等。李江明等[44]將羅非魚魚鱗膠原蛋白多肽與菠蘿果汁結(jié)合,得到了一款營養(yǎng)豐富、穩(wěn)定性好的膠原蛋白果味飲料,許佩云等[45]利用羅非魚魚鱗膠原蛋白與木糖醇、卡拉膠等結(jié)合,生產(chǎn)出了一款風(fēng)味獨(dú)特、爽口、營養(yǎng)全面且具有一定的保健功能的羅非魚魚鱗膠原蛋白凝凍休閑食品。慕現(xiàn)敏等[46]研究結(jié)果顯示:膠原蛋白中特有的羥脯氨酸是將人體血漿中的鈣運(yùn)輸?shù)焦趋乐械闹匾ぞ?故膠原蛋白也是一種補(bǔ)鈣食品。膠原蛋白還是優(yōu)良的增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑,故其常作為添加劑加入飲料、罐頭等中。魚鱗膠原蛋白還具有良好的成膜性,可以制成阻氧性、阻油性很好的可食性保鮮膜[47]。既保證了食品的品質(zhì),又增強(qiáng)了食品的營養(yǎng)。

4.4 羅非魚魚鱗膠原蛋白在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用

魚鱗中含有較多的膠原蛋白及羥基磷灰石,可作為吸附材料對有毒有害物質(zhì)如:染料[48]、酚類試劑[49]、金屬離子[50]等進(jìn)行吸附,減輕環(huán)境負(fù)擔(dān)。有研究表明:魚鱗對環(huán)境污染物的吸附屬于多層吸附,包括化學(xué)吸附以及物理吸附。魚鱗膠原蛋白中參與吸附過程的主要包括氨基、羧基、羥基等,能與有機(jī)物發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),吸附機(jī)理主要是靜電吸附作用及疏水相互作用。羥基磷灰石則可通過離子交換、表面吸附、溶解沉淀進(jìn)行吸附[51]。羥基磷灰石還可作為催化載體及緩釋載體制備催化劑、緩釋劑和抗菌劑等,具有可重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)。

5 結(jié)論與展望

通過對羅非魚魚鱗膠原蛋白的組成、結(jié)構(gòu)、提取工藝、性能及其應(yīng)用進(jìn)行了分析,得到:羅非魚魚鱗膠原蛋白是I型膠原蛋白,無毒、有較好的相容性、保水性、抗氧化性等,能被人體較好吸收。相較于傳統(tǒng)提取方法——熱水法、酸提取法、堿提取法、酶提取法,目前使用更多的是聯(lián)合提取法,主要包括酸酶法、超聲波輔助提取以及擠壓—加氫提取法,其效率更高,效果更好,提取的羅非魚魚鱗膠原蛋白主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化妝品、食品以及環(huán)境保護(hù)方面,發(fā)展前景廣闊。但當(dāng)前對魚鱗膠原蛋白的研究還存在不足,還有以下問題亟待解決:在應(yīng)用上,如何解決其致敏問題、研發(fā)生產(chǎn)新型止血材料;在提取方法上,如何運(yùn)用多種提取方法來提高羅非魚魚鱗膠原蛋白提取率、降低成本,如何運(yùn)用超聲波技術(shù)輔助羅非魚魚鱗膠原蛋白的提取。