靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠免疫功能的影響

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(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510275)

靈芝屬于擔(dān)子菌綱多孔菌科(Polyproraceae)靈芝屬(Ganoderma)真菌,是赤芝(G.lucidumKarst)和紫芝(G.JaponicumLloyd)的總稱[1],是一種重要的藥食用真菌,素有“仙草”和“瑞草”的美稱。靈芝孢子是子實(shí)體成熟后從菌蓋子實(shí)層內(nèi)噴射出來的粉末狀的生殖細(xì)胞,其所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是靈芝子實(shí)體的數(shù)十倍[2],主要活性成分有糖肽類、氨基酸類、三萜類、核苷類、脂肪酸類、呋喃類衍生物、甾醇類、生物堿類和微量元素等[3-4],具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、保肝護(hù)肝、降血糖血脂等多種生理活性[5-8]。

蜂膠(propolis)是蜜蜂從植物芽孢或樹干破皮傷口處采集來的樹脂(樹膠),并混入蜜蜂上顎腺的分泌物,與少量花粉、蜂蠟等加工而成的一種具有芳香氣味的固體膠狀粘性物質(zhì)[9],有“紫色黃金”之稱。目前已從蜂膠中分離出300多種化學(xué)成分,主要有效成分包括黃酮類、酚酸類、酯類、多糖、氨基酸、揮發(fā)性物質(zhì)、萜類等[10-12],具有抗病毒、抑菌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗氧化、肝保護(hù)、調(diào)節(jié)血糖血脂等多種生理活性[13-16]。

現(xiàn)今市場(chǎng)上出現(xiàn)了許多靈芝孢子和蜂膠的復(fù)合產(chǎn)品,但關(guān)于此復(fù)方生理作用的研究多為降脂[17]、抑制胃潰瘍[18]等方面,而在免疫調(diào)節(jié)方面的研究極少。王麗妮[19]證明由靈芝、蜂膠、精氨酸、蛋氨酸、β-胡蘿卜素、富硒酵母組成的“壽百星”膠囊具有增強(qiáng)非特異性免疫和特異性細(xì)胞免疫的作用,但是關(guān)于靈芝孢子和蜂膠組成的復(fù)方對(duì)非特異性免疫、細(xì)胞免疫以及體液免疫的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以靈芝孢子粉和蜂膠組成的復(fù)合物為原料,研究其對(duì)小鼠非特異性免疫、細(xì)胞免疫以及體液免疫的作用,期待為此類復(fù)合功能產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物 由廣州市眾享生物科技有限公司提供,復(fù)合物由靈芝孢子粉和蜂膠按質(zhì)量1∶1組成,其中靈芝孢子粉來源于廣西百色地區(qū),蜂膠來源于大別山,靈芝孢子粉采用低溫破壁,天然蜂膠凍干后研磨成細(xì)粉,將兩者混合攪拌均勻,所得復(fù)合物為棕褐色粉末,在蒸餾水中呈深棕色混懸液,實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配成所需濃度;SPF級(jí)昆明種雌性小鼠 共160只,4～5周齡,體重為18～22 g,由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2016-0029,飼養(yǎng)于中山大學(xué)(生命科學(xué)大學(xué)院中藥與海洋藥物研究所),試驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)為SYXK(粵)2014-0020;無菌脫纖維雞血、無菌脫纖維羊血、補(bǔ)體、小牛血清 廣州鴻泉生物科技有限公司;Drabkin’s Reagent(都氏試劑)、L-谷氨酰胺 美國(guó)sigma公司;印度墨水、SA緩沖液、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、刀豆蛋白(ConA) 上海源葉生物科技有限公司;RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液 蘇州賽默飛世爾儀器有限公司;hanks緩沖液、青霉素鈉、硫酸鏈霉素、β-巰基乙醇 北京索萊寶生物科技有限公司;Gimsa染液 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS) 北京藍(lán)景科信技術(shù)有限公司;24孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板 美國(guó)康寧;實(shí)驗(yàn)過程中所用的化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

754紫外可見分光光度計(jì) 上海公譜儀器有限公司;HERAcell 150i二氧化碳培養(yǎng)箱和Multiskan FC酶標(biāo)儀 上海賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BA210型LED Digital Motic顯微鏡 麥克迪奧實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;LXJ-II C低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;MIKRO 120小型臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Hettich。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及灌胃 分組:將整個(gè)實(shí)驗(yàn)分成四個(gè)免疫組,每組小鼠40只,再將40只小鼠隨機(jī)分成4組,即對(duì)照組、靈芝孢子粉蜂膠低、中、高劑量組。其中免疫一組進(jìn)行免疫臟器質(zhì)量測(cè)定和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn);免疫二組進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)和血清溶血素的測(cè)定;免疫三組進(jìn)行小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳粒廓清實(shí)驗(yàn);免疫四組進(jìn)行刀豆蛋白(Con A)誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法參照國(guó)家衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[20]中增強(qiáng)免疫力功能檢測(cè)方法進(jìn)行。

灌胃:參考張艷[21]實(shí)驗(yàn)方法中關(guān)于劑量的選取,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了低、中、高劑量組,即75、150、450 mg/kg bw,分別相當(dāng)于人體推薦劑量的5、10、30倍。將靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物粉末用蒸餾水配成所需濃度,以灌胃的方式對(duì)小鼠進(jìn)行給藥,灌胃劑量為0.1 mL/10 g bw,每天一次,連續(xù)30 d,對(duì)照組給予等體積的蒸餾水。

1.2.2 小鼠體重變化的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開始前稱重并記錄每只小鼠的重量,最后一次給藥24 h后稱重并記錄其體重。

1.2.3 免疫臟器指數(shù)測(cè)定 小鼠最后一次給藥24 h后,稱重,頸椎脫臼法處死小鼠,解剖取胸腺和脾臟,用濾紙吸干表面血污后用電子天平分別稱重,計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

1.2.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(半體內(nèi)法) 最后一次給藥24 h后,腹腔注射1 mL 20%的雞紅細(xì)胞懸液,30 min后頸椎脫臼處死小鼠,將其腹部朝上固定在鼠板上,正中剪開腹壁皮膚,經(jīng)腹腔注射2 mL生理鹽水,用手輕輕按揉腹部30次。用吸管吸出腹腔洗液,平均分滴于兩片載玻片上,放入墊有濕紗布的搪瓷盒中,放置在37 ℃孵箱中溫育30 min。溫育結(jié)束后在生理鹽水中漂洗,除去未貼片細(xì)胞。取出晾干,以1∶1丙酮甲醇溶液固定5 min,然后以4%(體積分?jǐn)?shù))Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min,用蒸餾水漂洗后取出晾干,在40倍顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),按下式計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.2.5 綿羊紅細(xì)胞(SRBC)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足趾增厚法) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5 d,通過腹腔注射0.2 mL(約1×106個(gè)SRBC)2%(體積分?jǐn)?shù))的SRBC進(jìn)行免疫。4 d后,測(cè)量左后足趾部厚度,然后在測(cè)量部位皮下注射20% SRBC,每只小鼠的注射劑量為20 μL(約1×102個(gè)SRBC),24 h后測(cè)量左后足趾部厚度。同一部位測(cè)量三次,兩次測(cè)量厚度的平均值之差即可反映小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的程度。

1.2.6 半數(shù)溶血值(HC50)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5 d,通過腹腔注射0.2 mL(約1×106個(gè)SRBC)2%的SRBC進(jìn)行免疫。5 d后,摘除眼球取血置于離心管內(nèi),室溫放置約1 h,用注射器針頭將凝固血與管壁剝離,使血清充分析出,室溫下2000 r/min離心10 min,收集血清。用SA緩沖液將血清稀釋200倍,取稀釋后的血清1 mL置試管內(nèi),依次加入10% SRBC 0.5 mL、補(bǔ)體1 mL(用SA緩沖液按1∶10稀釋),另設(shè)不加血清的(以SA緩沖液代替)對(duì)照管。37 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min后在冰浴上終止反應(yīng),2000 r/min離心10 min,取上清液1 mL于新試管中,加入3 mL都氏試劑;同時(shí)取0.25 mL 10% SRBC于另一只試管內(nèi),加入3.75 mL都氏試劑,充分搖勻,放置10 min后,以對(duì)照管作空白,540 nm處分別測(cè)定各管的光密度值,按下式計(jì)算半數(shù)溶血值。

1.2.7 小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳粒廓清實(shí)驗(yàn) 最后一次給藥24 h后,通過尾靜脈注射用生理鹽水稀釋了4倍的印度墨汁,注射劑量為0.1 mL/10 g bw。注入墨汁后立即開始計(jì)時(shí),于2 min(t1)、17 min(t2)時(shí)分別通過眼球內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL,立即加入到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。以Na2CO3溶液作空白對(duì)照,用分光光度計(jì)測(cè)量600 nm處的光密度值(OD)。取血完后將小鼠脫頸椎處死,解剖取其脾臟和肝臟,用濾紙吸干表面的血污后稱重。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)a。

式中:k表示未校正的吞噬指數(shù);a表示經(jīng)校正的吞噬指數(shù);OD1和OD2分別為2、17 min時(shí)的光密度值。

1.2.8 刀豆蛋白(Con A)誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法) 最后一次給藥24 h后,采用頸椎脫臼法處死小鼠,無菌取脾,置于盛有Hank’s液平皿中的200目無菌不銹鋼網(wǎng)上,用注射器針芯輕輕研磨脾臟,制成單細(xì)胞懸液。用Hank’s液洗滌3次,每次1000 r/min離心10 min。然后將細(xì)胞懸浮于1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)液中,顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液分兩孔加入到24孔培養(yǎng)板中,每孔1 mL,其中一孔加入75 μL Con A液(終濃度為7.5 μg/mL),另一孔不加Con A液作為對(duì)照,置于二氧化碳培養(yǎng)箱中以5% CO237 ℃條件培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h,每孔輕輕吸去上清液0.7 mL,加入不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液0.7 mL,同時(shí)加入50 μL MTT(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入1 mL酸性異丙醇,吹打混勻,使紫色結(jié)晶完全溶解,然后分裝到96孔培養(yǎng)板中,每孔作3個(gè)平行,用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm波長(zhǎng)下的光密度值。脾淋巴細(xì)胞的增殖能力可表示為加Con A液孔的光密度值減去不加Con A液孔的光密度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠體重變化的影響

從表1可以看出,四個(gè)免疫組低、中、高劑量的靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠體重的變化與對(duì)照組相比無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05),說明該復(fù)合物對(duì)小鼠體重的變化無明顯影響。但是同一劑量不同免疫組之間的體重變化存在一定差異,對(duì)照組小鼠中免疫一組的體重變化與其它三個(gè)免疫組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05);給予低劑量受試物中免疫一組小鼠體重變化與其它三個(gè)免疫組相比有顯著差異(p<0.05);給予中劑量受試物中免疫一組小鼠體重變化與免疫二組之間差異顯著(p<0.05);給予高劑量受試物中免疫一組體重變化與免疫四組之間差異顯著(p<0.05),說明小鼠的體重變化可能受外界條件及遺傳特性等因素的影響。

表1 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠體重的影響Table 1 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on body weight of mice

2.2 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠免疫臟器指數(shù)的影響

脾臟和胸腺是免疫系統(tǒng)中重要的免疫器官,其質(zhì)量在一定程度上可反映免疫功能的大小,從表2可知,低、中、高劑量靈芝孢子粉蜂膠處理組的小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與對(duì)照組相比雖然都有所提高,但均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05),表明靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠脾臟和胸腺的質(zhì)量無明顯影響,對(duì)免疫器官無刺激作用。

表2 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠免疫臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of Ganoderma lucidum spores propolis complex on immune organ index of mice

2.3 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

從表3中可以看出,中、高劑量靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物處理組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)顯著(p<0.05)高于對(duì)照組,而低劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)與對(duì)照組相比無顯著(p>0.05)差異。以上結(jié)果表明靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物能夠顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

表3 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響Table 3 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on peritoneal macrophage phagocytosis ability to chicken-red-blood cells of mice

2.4 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響

從表4可以看出,與對(duì)照組相比,中、高劑量處理組小鼠的足趾腫脹度極顯著升高(p<0.01),而低劑量處理組小鼠的足趾腫脹度與對(duì)照組相比無顯著差異(p>0.05),結(jié)果說明靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物具有促進(jìn)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用。

表4 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響Table 4 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on delayed-type hypersensitivity of mice

2.5 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響

由表5可知,三個(gè)劑量組小鼠血清半數(shù)溶血值隨靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物灌胃劑量的增加而升高,低劑量組與對(duì)照組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05),中、高劑量組與對(duì)照組相比其統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(p<0.01)。以上結(jié)果表明,靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物能顯著提高小鼠血清溶血素水平。

表5 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響Table 5 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on serum hemolysin capacity of mice

2.6 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠單核—巨噬細(xì)胞碳粒廓清能力的影響

由表6可知,三個(gè)劑量靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物處理組小鼠單核—巨噬細(xì)胞的碳廓清吞噬指數(shù)與對(duì)照組相比均無顯著差異(p>0.05),說明該復(fù)合物對(duì)單核-巨噬細(xì)胞的碳粒廓清能力無明顯的增強(qiáng)作用。胡怡秀等[22]通過實(shí)驗(yàn)證明1.101 g/kg bw的蜂膠能明顯增強(qiáng)小鼠的碳粒廓清能力(p<0.05),張榮標(biāo)等[23]通過灌胃給予ICR清潔小鼠125、250、750 mg/kg bw的破壁靈芝孢子粉30 d后進(jìn)行免疫指標(biāo)檢測(cè),結(jié)果顯示250 mg/kg bw的靈芝孢子粉能夠顯著增強(qiáng)小鼠的碳粒廓清能力(p<0.05)。兩位的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同,可能由于劑量效應(yīng)導(dǎo)致,高劑量復(fù)合物中靈芝孢子粉和蜂膠的劑量均為225 mg/kg bw,未達(dá)到胡怡秀以及張榮標(biāo)實(shí)驗(yàn)中引起碳廓清指數(shù)增強(qiáng)的劑量水平。

表6 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠碳粒廓清能力的影響Table 6 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on carbon clearance ability of mice

2.7 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

從表7可得知,三個(gè)劑量組的脾淋巴細(xì)胞增能力均高于對(duì)照組,且隨著劑量的加大其脾淋巴細(xì)胞的增殖能力也逐漸增加,但只有靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物中、高劑量處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力極顯著高于(p<0.01)對(duì)照組,而低劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組相比無顯著差異(p>0.05)。結(jié)果說明靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力具有一定的促進(jìn)作用。

表7 靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響Table 7 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on spleen lymphocyte proliferation ability of mice

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,中、高劑量靈芝孢子粉復(fù)合物能夠提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力,說明該復(fù)合物對(duì)單核-巨噬細(xì)胞的功能具有促進(jìn)作用;中、高劑量靈芝孢子粉復(fù)合物能顯著增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度以及小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力,說明該復(fù)合物對(duì)細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用;低、中、高劑量靈芝孢子粉復(fù)合物能顯著提高血清溶血素水平,說明該復(fù)合物對(duì)體液免疫功能具有促進(jìn)作用;根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中關(guān)于增強(qiáng)免疫力功能的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),可認(rèn)為靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物具有增強(qiáng)免疫力功能的作用。

本研究從非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫三個(gè)方面證明了靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物能夠促進(jìn)機(jī)體的免疫功能,為此類復(fù)合產(chǎn)品作為保健產(chǎn)品的推廣使用提供了可靠的理論支撐。但未深入探究靈芝孢子粉蜂膠復(fù)合物增強(qiáng)免疫功能的分子作用機(jī)制以及靈芝孢子粉和蜂膠間的作用效果是屬于協(xié)同還是拮抗,有必要在今后對(duì)其相互作用效果及作用機(jī)制作進(jìn)一步探討,從而為此類復(fù)合物的應(yīng)用研究提供更全面的參考信息。