刺參粗多糖對(duì)糖酵解與有氧氧化過程關(guān)鍵酶活性的影響

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(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600)

能量代謝是有機(jī)體在物質(zhì)代謝中能量的產(chǎn)生、釋放、轉(zhuǎn)換及利用的過程。細(xì)胞的主要能量來源為糖代謝,葡萄糖在體內(nèi)主要以糖酵解和氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation,OXPHOS)兩種途徑進(jìn)行氧化分解,其中OXPHOS是糖代謝的主要方式[1]。腫瘤細(xì)胞具有多種典型的特征,代謝異常是腫瘤細(xì)胞十大顯著特點(diǎn)之一[2]。腫瘤糖代謝異常十分關(guān)鍵,德國生理學(xué)家Warburg提出了著名的“Warburg效應(yīng)”[3],即在供氧充足時(shí),腫瘤細(xì)胞大多通過糖酵解途徑產(chǎn)能,并產(chǎn)生大量的乳酸,卻很少利用產(chǎn)能更高的OXPHOS。癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的能量代謝方式不同,正常細(xì)胞有氧條件下以有氧氧化為主,只有供氧不足時(shí)才會(huì)以糖酵解途徑供能,而癌細(xì)胞無論是有氧還是缺氧條件下均優(yōu)先以糖解途徑供能,這種能量代謝方式使其在缺氧條件下具有更強(qiáng)的耐受能力[4],同時(shí)推測線粒體代謝異常是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)[5]。腫瘤以細(xì)胞能量代謝途徑轉(zhuǎn)換為特點(diǎn),從正常細(xì)胞依賴的OXPHOS產(chǎn)能向糖酵解產(chǎn)能的轉(zhuǎn)換[6]。在糖酵解過程中有多種關(guān)鍵酶,如己糖激酶(Hexokinase,HK)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(3-glyceraldehyde phosphate delydrogenase,GAPDH)、乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)等,這些酶的活性高低直接影響糖酵解途徑[7],這些糖酵解關(guān)鍵酶也在惡性腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá),若抑制糖酵解關(guān)鍵酶,阻斷糖酵解途徑,從而切斷腫瘤的能量供應(yīng),則可抑制大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中能量的合成,從而減緩腫瘤細(xì)胞的增殖與發(fā)展[8]。近年來,線粒體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及在癌癥診斷治療中的意義日益受到關(guān)注。對(duì)于OXPHOS的關(guān)鍵酶,如丙酮酸脫氫酶(Pyruvate Dehydogenase,PDH)、線粒體復(fù)合體Ⅰ、線粒體復(fù)合體Ⅴ(ATP合酶)等,通過提高其活性來促進(jìn)OXPHOS產(chǎn)能,進(jìn)而有可能抑制癌細(xì)胞的增殖。

海參自古以來就被奉為營養(yǎng)佳品,營養(yǎng)價(jià)值主要源于由氨基半乳糖、己糖醛酸、巖藻糖、硫酸基組成的多糖[9],其糖鏈的部分羥基可發(fā)生硫酸酯化,且硫酸化程度與其抗腫瘤作用相關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)海參多糖具有明顯的抗腫瘤活性,其抑瘤率為73.56%[11],海參多糖在體外呈濃度依賴性促進(jìn)人腎癌細(xì)胞786-0凋亡[12],北極海參多糖具有較強(qiáng)的體外抗腫瘤作用[13]。目前海參多糖的抗腫瘤作用研究較多,但是對(duì)其與糖酵解與有氧氧化的聯(lián)系方面報(bào)道較少。

刺參具有“海參之冠”之稱,本文選用刺參粗多糖(Stichopusjaponicuscrude polysaccharides,SJP)為研究對(duì)象,從改善線粒體生物能學(xué)即激活氧化磷酸化產(chǎn)能,抑制糖酵解產(chǎn)能的角度探索其防癌機(jī)制,為癌癥研究提供新的視角、新的思路和新的希望。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小鼠 雄性,重量(22.13±0.95) g,24只,大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào):SCXK 2014-0002);干刺參 大連曉芹食品有限公司;木瓜蛋白酶(酶活80萬U/g)、胃蛋白酶(酶活3000～3500 NFU/g)、胰蛋白酶(酶活>250NFU/mg) 北京索萊寶科技有限公司;LDH試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):20171028)、GAPDH檢測試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):20171108)、HK測試盒(生產(chǎn)批號(hào):20171102)、PDH試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):20171102)、線粒體復(fù)合體Ⅰ活性試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):20171102)、線粒體復(fù)合體Ⅴ活性測試盒(生產(chǎn)批號(hào):20171102) 北京索萊寶科技有限公司;牛血清白蛋白 荷蘭Boehringer Mannheim公司;考馬斯亮藍(lán)G-250染色液 美國Fluka公司;其他試劑 均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;TGL-18M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;Polystat 34恒溫水浴鍋 美國Techne公司;UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SJP的提取

1.2.1.1 木瓜蛋白酶水解法提取SJP 用中草藥粉碎機(jī)將干刺參粉碎,過60目篩,所得為刺參干粉,稱取刺參干粉10 g,加入丙酮溶液60 mL于4 ℃浸泡24 h,倒出丙酮溶液,刺參粉室溫(20 ℃)下?lián)]發(fā)完全,然后放置24 h(20 ℃),向揮出丙酮的刺參干粉中加入木瓜蛋白酶1 g與0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH為6.0,含半胱氨酸鹽酸鹽和乙二胺四乙酸二鈉的濃度為5 mmol/L)300 mL,60 ℃水浴24 h。取出冷卻,10000 r/min 20 ℃離心5 min,收集上清液。向上清液中加入10%的氯化十六烷基吡啶溶液(w/v)16 mL,靜置24 h,分層后6000 r/min 20 ℃離心20 min,收集沉淀。用20 mL NaCl乙醇溶液(3 moL/L NaCl溶液:乙醇=100/15 v/v),將沉淀完全溶解。向溶解液中加入95%乙醇溶液40 mL,充分?jǐn)嚢韬? ℃靜置12 h過夜。溶液分層后6000 r/min 4 ℃離心20 min,用10 mL 80%和95%乙醇溶液洗沉淀2～3次后,60 ℃烘干2 h,即得SJP,采用硫酸苯酚法[14]測定糖含量,計(jì)算SJP糖部分含量為30%,考慮到糖鏈上有部分羥基發(fā)生硫酸酯化的影響,且硫酸基含量占多糖的30%左右[15],故實(shí)際SJP多糖含量約為60%。

1.2.1.2 胃蛋白酶與胰蛋白酶水解法提取SJP 具體操作方法參照文獻(xiàn)[16],所得SJP以硫酸苯酚法測定糖含量,經(jīng)計(jì)算為33%,考慮到硫酸基的影響,故實(shí)際SJP多糖含量約為63%。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理 實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)小鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成正常對(duì)照組、SJP 1組(木瓜蛋白酶水解法制備的刺參多糖)、SJP 2組(胃蛋白酶與胰蛋白酶水解法制備的刺參多糖),每組8只小鼠,稱重(g),給藥10 d,觀察小鼠狀態(tài)。SJP組灌胃劑量為200 mg/kg/d,每日1次,正常對(duì)照組小鼠每天灌胃等體積生理鹽水。結(jié)束后記錄灌藥后鼠重(g),處死小鼠,迅速取出肝臟、骨骼肌等組織,進(jìn)行相應(yīng)處理并檢測HK、GAPDH、LDH、PDH、線粒體復(fù)合體Ⅰ與復(fù)合體Ⅴ活性等各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3 糖酵解關(guān)鍵酶活性測定 檢測糖酵解過程中關(guān)鍵酶HK、GAPDH、LDH活性。

HK活性測定用小鼠肝組織,GAPDH與LDH活性測定用小鼠股四頭肌。按照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作并計(jì)算結(jié)果。

1.2.4 有氧氧化關(guān)鍵酶活性測定 檢測糖有氧氧化過程中關(guān)鍵酶PDH、線粒體復(fù)合體Ⅰ與復(fù)合體Ⅴ活性。PDH、線粒體復(fù)合體Ⅰ與復(fù)合體Ⅴ活性用小鼠肝組織進(jìn)行測定。按照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行操作并計(jì)算結(jié)果。

1.2.5 生物能指數(shù)測定 生物能指數(shù)是指線粒體的ATP合酶(復(fù)合體Ⅴ)與糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶(3-GAPDH)的活性比。復(fù)合體Ⅴ與3-GAPDH的活性已分別在1.2.3與1.2.4中進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 糖酵解關(guān)鍵酶活性分析

糖酵解是腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)的重要手段,腫瘤糖酵解活性的升高在細(xì)胞水平表現(xiàn)為乳酸生成與葡萄糖消耗比的增加[17],糖酵解過程產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物又可被腫瘤細(xì)胞利用,用于合成細(xì)胞增殖所需的原料,從而促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移等。研究發(fā)現(xiàn),小鼠乳腺癌細(xì)胞的糖酵解活性約是正常細(xì)胞的2～17倍[18]。

糖酵解過程有賴于關(guān)鍵性酶的催化。HK催化糖酵解的啟動(dòng)步驟,使葡萄糖磷酸化形成葡萄糖-6-磷酸,HK 4種亞型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)在正常細(xì)胞中通常低表達(dá),而在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[19],王秀等[20]研究表明,可通過降低卵巢癌細(xì)胞中的HK活性,抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。由表1可知,灌藥組小鼠HK活性與對(duì)照組相比均下降,且呈現(xiàn)顯著性(p<0.05)差異,SJP 1組HK活性高于SJP 2組,但兩組間無顯著性差異(p>0.05),說明SJP能抑制HK活性,從而抑制糖酵解過程的第一步,使產(chǎn)能向OXPHOS方向進(jìn)行。

表1 SJP對(duì)糖酵解酶活性的影響Table 1 Effects of SJP on glycolytic enzyme activity

GAPDH催化甘油醛-3-磷酸形成1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH在多種癌癥中上調(diào),如肝癌、肺癌,但其具體作用及機(jī)制尚不明確。研究表明GAPDH能夠激活細(xì)胞增殖,加劇肝癌的發(fā)生發(fā)展。因此得出GAPDH可以促進(jìn)癌癥的發(fā)生[21]。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與對(duì)照組相比,灌藥組小鼠GAPDH活性均降低,且呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.05),SJP 1組GAPDH活性高于SJP 2組,說明SJP可抑制GAPDH活性,進(jìn)而可能阻止癌癥的發(fā)生。

LDH催化丙酮酸生成乳酸,是糖酵解過程最后一步反應(yīng)的催化酶,推動(dòng)著糖酵解循環(huán)的進(jìn)行。LDH有5種同工酶,其中乳酸脫氫酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)與腫瘤的發(fā)生最為密切。c-Myc上調(diào)LDHA基因的表達(dá),使得腫瘤細(xì)胞進(jìn)行高效有氧糖酵解,并可促進(jìn)腫瘤的生長[22]。已有研究報(bào)道,LDHA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中有較高表達(dá),而在正常的神經(jīng)組織和細(xì)胞中的表達(dá)較低[23]。灌藥組小鼠的LDH與對(duì)照組比較均下降,且呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.05),SJP 1組LDH活性高于SJP 2組,說明SJP可抑制LDH活性,進(jìn)而抑制糖酵解過程?？傊?SJP能抑制HK、LDH和GAPDH的活性,進(jìn)而抑制糖酵解的進(jìn)行,影響其產(chǎn)能,推測SJP可能具有抑制腫瘤增長與擴(kuò)散作用。

2.2 有氧氧化關(guān)鍵酶活性分析

線粒體OXPHOS是機(jī)體的重要能量來源,由線粒體內(nèi)膜呼吸鏈完成,呼吸鏈復(fù)合體是主要參與者。正常生理狀態(tài)下,人體80%以上的能量來源于線粒體OXPHOS[24]。PDH是丙酮酸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,在線粒體中將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A,進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)而通過OXPHOS產(chǎn)能。PDH活性的重要調(diào)節(jié)劑是PDH激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK),通過促使PDH特定絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化使PDH失活[25],導(dǎo)致丙酮酸進(jìn)入線粒體的量減少,生成大量的乳酸。一些PDK的亞型在各種腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)[26],且對(duì)維持腫瘤有氧糖酵解起到重要作用。若提高PDH活性則可促進(jìn)丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán),使產(chǎn)能向OXPHOS方向進(jìn)行。

線粒體呼吸鏈復(fù)合體I是呼吸鏈電子傳遞的起始復(fù)合體,位于線粒體內(nèi)膜上,將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所帶電子通過FMN和Fe-S簇中的Fe原子傳給泛醌,將質(zhì)子從基質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體膜間腔,形成跨內(nèi)膜的質(zhì)子電化學(xué)梯度,驅(qū)動(dòng)復(fù)合體Ⅴ合成ATP[27-28]。

復(fù)合體V是線粒體呼吸鏈的最后一個(gè)復(fù)合物,在線粒體中通過電化學(xué)梯度傳遞質(zhì)子,以ADP、Pi及Mg2+為原料合成ATP,為細(xì)胞供能[29]。線粒體呼吸受損引起的NADH升高可導(dǎo)致Akt通路的激活,Akt通路的激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解[30]。

由表2可知,灌藥組小鼠的PDH、線粒體復(fù)合體I、復(fù)合體V的活性與對(duì)照組相比均有所升高,且呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.05),SJP 1組PDH、線粒體復(fù)合體I、復(fù)合體V的活性均低于SJP 2組,且兩組間均無顯著性差異(p>0.05),說明SJP可促進(jìn)上述酶的活性,進(jìn)而促進(jìn)OXPHOS進(jìn)行,如果可以調(diào)節(jié)腫瘤代謝途徑,控制腫瘤的能量代謝方式,使其向OXPHOS產(chǎn)能方向進(jìn)行,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,則可以有針對(duì)性的治療惡性腫瘤。

表2 SJP對(duì)有氧氧化酶活性的影響Table 2 Effects of SJP on aerobic oxidase activity

2.3 鼠重與生物能指數(shù)分析

多種腫瘤細(xì)胞中都存在線粒體功能紊亂,線粒體功能異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段也扮演重要的角色。

由表3可知，灌藥前SJP組鼠重與對(duì)照組比較均無顯著性差異(p>0.05),灌藥后SJP組與對(duì)照組比較均有所增加,且SJP 2組存在顯著性差異(p<0.05),SJP組灌藥前與灌藥后鼠重均增加且存在顯著性差異(p<0.05),說明SJP對(duì)小鼠的生長有促進(jìn)作用。灌藥后小鼠好動(dòng),毛色光鮮順滑。

表3 SJP對(duì)鼠重與生物能指數(shù)的影響Table 3 Effects of SJP on the weight of mice and bioenergetic index

生物能指數(shù)是指線粒體的ATP合酶與糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶的活性比,其決定腫瘤的侵襲性,生物能指數(shù)也從側(cè)面說明了線粒體的活性高低。SJP組的生物能指數(shù)與對(duì)照組相比均有所升高,且有顯著性差異(p<0.05),SJP 2組有較顯著差異(p<0.01)。SJP使生物能指數(shù)升高,說明其使小鼠更傾向于OXPHOS產(chǎn)能,從而可能利于抑制腫瘤的侵襲。

3 討論與結(jié)論

Warburg效應(yīng)在各種惡性腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織中普遍存在,例如乳腺癌、肝癌、胃癌及腦組織惡性腫瘤等[31-32],大部分惡性腫瘤已經(jīng)顯示糖酵解效率和乳酸產(chǎn)量均上調(diào)[33]。Warburg效應(yīng)不僅增強(qiáng)了糖酵解作用,同時(shí)也通過將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸而抑制了線粒體OXPHOS的作用。糖酵解為腫瘤細(xì)胞的生存和侵襲提供了優(yōu)勢(shì)條件,有益于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[34]。研究表明,為了適應(yīng)周圍微環(huán)境,腫瘤細(xì)胞可能通過異常信號(hào)通路重排代謝方式,重排的代謝方式有利于維持腫瘤的生長增殖等[35]。另一方面,為了對(duì)自身起到有效的適應(yīng)性保護(hù),腫瘤細(xì)胞需要大量能源來維持高耗能的耐藥通路,對(duì)糖酵解的依賴進(jìn)一步增加[36]。因此,如果能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的代謝方式進(jìn)行有效轉(zhuǎn)變,就有可能遏制腫瘤細(xì)胞惡性增殖,并改善腫瘤細(xì)胞對(duì)治療藥物的敏感性。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種方法提取的SJP均能抑制糖酵解關(guān)鍵酶活性,促進(jìn)OXPHOS過程關(guān)鍵酶活性,說明SJP有可能通過改變代謝方式來抑制癌癥的發(fā)生,但其具體的作用機(jī)制還需更進(jìn)一步探索。