復(fù)合菌發(fā)酵米乳飲料的配方優(yōu)化及其儲藏品質(zhì)變化

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(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070；2.中南林業(yè)科技大學(xué)稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙 410004)

米乳飲料是一種以大米、碎米或米粉為主要原料,輔以奶粉或一些其它營養(yǎng)物質(zhì),研制的一種健康的谷物飲料[1]。根據(jù)生產(chǎn)工藝,可分為非發(fā)酵型和發(fā)酵型兩種。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的米乳飲料不僅可以提高米乳的營養(yǎng)價值、降低機(jī)體膽固醇[2-3],還可抑制有害微生物的生長、賦予米乳獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味[4-5]。

近年來,國內(nèi)外學(xué)者對發(fā)酵米乳飲料的發(fā)酵與營養(yǎng)特性、配方優(yōu)化等方面進(jìn)行了一系列研究,結(jié)果表明,在米乳發(fā)酵過程中,菌種將直接決定著產(chǎn)品品質(zhì),不同菌種相互作用,能制成不同風(fēng)味的米乳飲料。陳妍婕等、朱力杰等[6-7]研究了乳酸菌在發(fā)芽糙米乳中的發(fā)酵特性,從而篩選出了適合發(fā)酵發(fā)芽糙米乳的最佳菌株組合。陳海旭[8]研究發(fā)現(xiàn),復(fù)合菌發(fā)酵優(yōu)于單菌,不僅可彌補(bǔ)單菌發(fā)酵帶來的風(fēng)味單一缺陷,而且米乳的酸度、活菌數(shù)等指標(biāo)更加均衡。閆禎等[9]、鄒秀榮等[10]對乳酸菌米乳飲料的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,研發(fā)出了多種風(fēng)味獨(dú)特的米乳飲料。目前,研究較多的是植物乳發(fā)酵劑在米乳中的發(fā)酵特性,而關(guān)于動物乳發(fā)酵劑與植物乳發(fā)酵劑復(fù)配的研究較少。

因此,本研究通過比較商用酸奶發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的復(fù)配凍干菌粉)和實(shí)驗(yàn)室自行從傳統(tǒng)米漿中分離的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ZSM-002[11]在米乳中的發(fā)酵特性,選擇適宜復(fù)合菌,進(jìn)而研制出一種口感黏稠、風(fēng)味柔和的米乳飲料,為乳酸菌米乳飲料的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米粉 湖北黃岡東坡糧油集團(tuán)有限公司;脫脂乳粉 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司;MRS肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;商用酸奶發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌復(fù)配凍干菌粉,以下簡稱H) 北京川秀生物科技有限公司;植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ZSM-002(專利號:ZL2009100638581,以下簡稱Z) 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院食品大分子結(jié)構(gòu)與功能特性實(shí)驗(yàn)室保藏;海藻酸丙二醇酯 食品級,河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司;蔗糖脂肪酸酯 食品級,河南圣德斯實(shí)業(yè)有限公司;果膠 食品級,河南三化生物科技有限公司;黃原膠 食品級,山東阜豐發(fā)酵有限公司。

ZM-100全自動反壓高溫蒸煮鍋 廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司;HD-1360水平流超凈工作臺 哈爾濱東聯(lián)儀器公司;TDL-S-A臺式離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司;LRH-150B生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械;722S可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米乳飲料的制作 圖1為米乳飲料的制作工藝流程。

圖1 米乳飲料的制作工藝流程Fig.1 Production process of rice milk

混合米漿:稱取一定量米粉,按照一定的米水比加水調(diào)漿,將脫脂乳粉加水調(diào)配成10%的脫脂乳液,然后將脫脂乳液按一定比例加入米漿中,并添加5%葡萄糖和一定量白砂糖,攪拌均勻,得到混合米漿。

糊化:將混合米漿置于沸水浴中糊化30 min,不斷攪拌,防止糊化不均勻。

冷卻:將糊化后的混合米漿迅速冷卻至40 ℃以下。

接種發(fā)酵:向冷卻后的混合米漿中接種一定量發(fā)酵菌種,置于一定的恒溫條件下發(fā)酵一定時間。

穩(wěn)定劑:在穩(wěn)定劑的添加量為0.2%的前提下,研究海藻酸丙二醇酯、蔗糖脂肪酸酯、果膠、黃原膠4種穩(wěn)定劑的最佳配比。

儲藏:將發(fā)酵米乳飲料于4 ℃條件下儲藏9 d,分別在第1、3、5、7、9 d取樣測定其品質(zhì)。

1.2.2 適宜復(fù)合菌株的確定 結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)效果,按照米水比1∶15 (g/mL),葡萄糖添加量5%,脫脂乳添加量5%配制基礎(chǔ)米漿培養(yǎng)基,分別接種5%商用酸奶發(fā)酵劑,5%植物乳桿菌ZSM-002,5%復(fù)合菌種(商用酸奶發(fā)酵劑與植物乳桿菌ZSM-002的復(fù)配比分別為1∶1、1∶2、2∶1、3∶2、2∶3),于37 ℃發(fā)酵12 h,測定樣品的滴定酸度?；诋a(chǎn)酸曲線選出乳酸積累量最多的復(fù)配菌種,再通過活菌數(shù)、粗蛋白、可溶性蛋白及還原糖的含量分析,進(jìn)一步確定適宜發(fā)酵復(fù)合菌。

1.2.3 發(fā)酵米乳飲料的配方優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 分別研究米水比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)、脫脂乳加量(0%、5%、10%、15%、20%、25%)、白砂糖加量(0%、3%、5%、7%、9%、11%)、菌接種量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)、發(fā)酵時間(8、10、12、14、16、20、24 h)、發(fā)酵溫度(35、37、39、41、43 ℃)對發(fā)酵米乳滴定酸度、活菌數(shù)、感官評定的影響,其中,各添加量按其占米漿重量的百分比計(jì)。試驗(yàn)過程中的不變水平值為米水比1∶15 (g/mL),脫脂乳15%,白砂糖9%,接種5%的復(fù)配菌種,穩(wěn)定劑0.2%,37 ℃發(fā)酵12 h。

1.2.3.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果,以脫脂乳添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、菌接種量為考察因素,各選擇3個水平,以滴定酸度、活菌數(shù)、感官評定為評價指標(biāo)設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)(表1),確定發(fā)酵米乳飲料最佳制備條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.4 指標(biāo)的測定及感官評價標(biāo)準(zhǔn)滴定酸度的測定 參照GB 541334-2010《乳和乳制品酸度的測定》。乳酸菌活菌數(shù)的測定:參照GB 4789.35-2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳酸菌檢驗(yàn)》,采用平板計(jì)數(shù)法測定。粗蛋白含量的測定:參考GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》,采用凱氏定氮法?？扇苄缘鞍缀康臏y定:采用Folin-酚試劑法進(jìn)行測定。還原糖含量的測定:DNS法。

感官評價:由接受過專業(yè)培訓(xùn)的5人對米乳飲料的色澤、氣味、口感、組織狀態(tài)等指標(biāo)進(jìn)行分析,評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 米乳飲料感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation of rice milk

1.2.5 穩(wěn)定劑的確定 以離心沉淀率為指標(biāo),在穩(wěn)定劑的添加量為0.2%的前提下,選取海藻酸丙二醇酯、蔗糖脂肪酸酯、果膠、黃原膠四種穩(wěn)定劑,設(shè)計(jì)4因素5水平均勻試驗(yàn),研究米乳飲料的穩(wěn)定性,確定4種穩(wěn)定劑的添加比例。

穩(wěn)定性測定:在有刻度的離心管里,準(zhǔn)確加入米乳飲料10 mL,室溫下3500 r/min離心15 min,除去上層清液,準(zhǔn)確稱量沉淀物質(zhì)量,計(jì)算沉淀率[12]。離心沉淀率(%)=沉淀物質(zhì)量×100/10 mL米乳飲料重量。

1.2.6 儲藏品質(zhì)研究 將最佳條件制作的米乳于4 ℃冷藏條件下儲藏,每隔48 h取一次樣,測定米乳的滴定酸度、活菌數(shù),并對米乳進(jìn)行感官評價,研究米乳的儲藏品質(zhì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均進(jìn)行2次重復(fù),每次重復(fù)進(jìn)行3次平行,采用SAS 9.2和origin 8.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜復(fù)合菌株的確定

不同菌種在脫脂乳米漿培養(yǎng)基中產(chǎn)酸曲線如圖2所示。由于脫脂乳米漿培養(yǎng)基中含有糖類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),所以隨著發(fā)酵時間的延長,各組米漿培養(yǎng)基的滴定酸度均呈上升趨勢,各菌株產(chǎn)酸量均不斷增加。就單菌株來看,ZSM-002產(chǎn)酸量增加較快,最終的產(chǎn)酸量較高。將商用酸奶發(fā)酵劑、ZSM-002以不同比例進(jìn)行復(fù)配,發(fā)現(xiàn)兩者配比為3∶2時,其產(chǎn)酸速率、最終的產(chǎn)酸量最高,說明兩株菌之間存在一定的共生關(guān)系,且此種比例下,兩株菌的共生現(xiàn)象最明顯,更有利于產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的形成。

圖2 菌種的產(chǎn)酸曲線Fig.2 Acid production curves of bacteria注:H代表商用酸奶發(fā)酵劑,Z代表植物乳桿菌ZSM-002,H∶Z或H+Z代表復(fù)配菌(商用酸奶發(fā)酵劑與植物乳桿菌ZSM-002)；表3同。

不同菌發(fā)酵米乳的各項(xiàng)指標(biāo)測定結(jié)果如表3所示。不同菌發(fā)酵米乳的滴定酸度、活菌數(shù)、粗蛋白、可溶性蛋白、還原糖含量均有顯著性差異(p<0.05)。復(fù)合菌發(fā)酵米乳的滴定酸度遠(yuǎn)高于單菌發(fā)酵。ZSM-002發(fā)酵米乳的活菌數(shù)最高,復(fù)合菌發(fā)酵米乳的活菌數(shù)較商用酸奶發(fā)酵劑有明顯升高。商用酸奶發(fā)酵劑發(fā)酵米乳的粗蛋白含量高于ZSM-002和復(fù)合菌,粗蛋白含量的增加,并不全是蛋白質(zhì)的增加引起的,還可能是微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)類代謝產(chǎn)物,同時菌體本身也是一種蛋白質(zhì),發(fā)酵過程中大量增殖,從而增加了米乳中的蛋白質(zhì)含量[8]。ZSM-002和復(fù)合菌發(fā)酵米乳的可溶性蛋白含量較商用酸奶發(fā)酵劑有明顯升高。商用酸奶發(fā)酵劑發(fā)酵米乳的還原糖含量較ZSM-002、復(fù)合菌發(fā)酵米乳有所提高。因此,商用酸奶發(fā)酵劑與ZSM-002以3∶2的比例復(fù)配后發(fā)酵效果最好。

表3 發(fā)酵米乳的指標(biāo)測定結(jié)果Table 3 Results of index determination of fermented rice milk

2.2 發(fā)酵米乳飲料的配方優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 脫脂乳添加量對米乳飲料品質(zhì)的影響 脫脂乳添加量對米乳飲料滴定酸度、活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響如圖3所示。脫脂乳的添加量對其均有顯著影響(p<0.05)。隨著脫脂乳添加量的增多,米乳的酸度呈上升趨勢。活菌數(shù)則是先上升后下降,當(dāng)脫脂乳添加量為15%時,活菌數(shù)最高。脫脂乳能提高米乳感官品質(zhì),當(dāng)脫脂乳添加量高于5%時,感官評分無明顯變化,添加脫脂乳雖然能為乳酸菌提供生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì),但添加量過多時,會掩蓋米乳本身的米香味,同時也會提高成本[13]。

圖3 脫脂乳添加量對米乳飲料品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of degreased milk on the quality of rice milk注:不同的字母表示指標(biāo)不同時,米乳的滴定酸度、活菌數(shù)、感官評分均具有顯著性差異,p<0.05，圖4～圖9同。

2.2.1.2 白砂糖添加量對米乳飲料品質(zhì)的影響 白砂糖添加量對米乳飲料滴定酸度、活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響如圖4所示。隨著白砂糖加量增加,米乳酸度、活菌數(shù)均呈先上升后下降趨勢。當(dāng)白砂糖添加量為3%時,米乳酸度、活菌數(shù)最高。感官評分隨白砂糖加量的增加逐漸升高,當(dāng)白砂糖加量為9%時,感官評分最高?？紤]到產(chǎn)品接受度主要受感官評價影響,故選擇感官評分最高組(9%白砂糖添加量)進(jìn)行后續(xù)配方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖4 白砂糖添加量對米乳飲料品質(zhì)的影響Fig.4 Effects of sugar content on the quality of rice milk

2.2.1.3 菌接種量對米乳飲料品質(zhì)的影響 菌接種量對米乳飲料滴定酸度、活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響如圖5所示。隨著菌接種量的增加,米乳酸度、活菌數(shù)均呈先上升后無明顯變化,當(dāng)接種量大于3%時,酸度變化不再顯著(p>0.05)。當(dāng)接種量大于4%時,活菌數(shù)變化不再顯著(p>0.05)。感官評分隨菌接種量的增加逐漸升高,當(dāng)接種量為5%時,綜合評分最高。

圖5 菌接種量對米乳飲料品質(zhì)的影響Fig.5 Effects of inoculation amount on the quality of rice milk

2.2.1.4 發(fā)酵時間對米乳飲料品質(zhì)的影響 發(fā)酵時間對米乳飲料滴定酸度、活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響如圖6所示。隨發(fā)酵時間的延長,米乳的酸度呈上升趨勢,活菌數(shù)、感官評分均先升高后下降,12 h時達(dá)到最高。這是由于隨著發(fā)酵時間的延長,米漿中營養(yǎng)物質(zhì)減少、環(huán)境劣化,從而導(dǎo)致部分菌體死亡,活菌數(shù)下降[14],同時,發(fā)酵時間過長也會對米乳的感官品質(zhì)有所影響。

圖6 發(fā)酵時間對米乳飲料品質(zhì)的影響Fig.6 Effects of fermentation time on the quality of rice milk

2.2.1.5 發(fā)酵溫度對米乳飲料品質(zhì)的影響 發(fā)酵溫度對米乳滴定酸度、活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響如圖7所示,發(fā)酵溫度對其均有顯著影響(p<0.05)。隨發(fā)酵溫度的升高,米乳酸度呈上升趨勢,后趨于穩(wěn)定,活菌數(shù)和感官評分均呈下降趨勢,在35、37 ℃時,兩者均較高。

圖7 發(fā)酵溫度對米乳飲料品質(zhì)的影響Fig.7 Effects of fermentation temperature on the quality of rice milk

2.2.1.6 米水比對米乳飲料品質(zhì)的影響 米水比對米乳滴定酸度、活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響如圖8所示。隨著米水比的增加,米乳酸度逐漸下降,活菌數(shù)逐漸升高,綜合評分先升高后下降,綜合考慮,選擇米水比為1∶10 (g/mL)時較為合理。

圖8 米水比對米乳飲料品質(zhì)的影響Fig.8 Effects of feed water on the quality of rice milk

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、菌接種量、脫脂乳添加量4個因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9(34),綜合考察發(fā)酵米乳的滴定酸度、活菌數(shù)和感官品質(zhì),相對于滴定酸度,活菌數(shù)和感官品質(zhì)對于產(chǎn)品的接受度更為重要,因此選擇活菌數(shù)和感官品質(zhì)為主要指標(biāo),在活菌數(shù)和感官評分較高的情況下,綜合考慮米乳的滴定酸度,從而優(yōu)化發(fā)酵米乳最佳制備條件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of orthogonal test

對于A(發(fā)酵時間)因素,活菌數(shù)和感官評分都是取A1較好,且對于活菌數(shù),A因素是最主要的因素,在確定優(yōu)水平時應(yīng)重點(diǎn)考慮;對于滴定酸度,A是影響最小的因素,綜合考慮選取A1。對于B(發(fā)酵溫度)因素,3個指標(biāo)都取B2,因此,B2是較適宜的水平。對于C(菌接種量)因素,活菌數(shù)取C1,感官評分取C2,滴定酸度取C3,且C因素對活菌數(shù)的影響最大,且從K1、K2、K3看C值相差不大,因此綜合考慮選取C1。對于D(脫脂乳添加量)因素,重點(diǎn)考慮的活菌數(shù)和感官評分都取D2,滴定酸度取D3,且從K1、K2、K3看D值相差不大,因此綜合考慮選取D2。

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知(表5):4因素對滴定酸度均有極顯著性影響(p<0.01);發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、菌接種量對活菌數(shù)有極顯著性影響(p<0.01),脫脂乳添加量對活菌數(shù)有顯著性影響(p<0.05);發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、脫脂乳添加量對感官有極顯著性影響(p<0.01),菌接種量對感官有顯著性影響(p<0.05)。綜合上述,最優(yōu)組合為A1B2C1D2,即最佳品質(zhì)制備條件為發(fā)酵時間10 h,發(fā)酵溫度37 ℃,菌接種量3%,脫脂乳添加量為10%,于優(yōu)化條件下進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測得滴定酸度為(17.03±0.92) °T,活菌數(shù)為(8.53±0.08)lg (cfu/mL),感官評分為(8.83±0.20)分。

表5 正交試驗(yàn)方差分析表(F/P)Table 5 Analysis of variance for orthogonal test(F/P)

2.3 米乳的穩(wěn)定性研究

復(fù)合穩(wěn)定劑均勻設(shè)計(jì)結(jié)果如表6所示。對結(jié)果進(jìn)行分析,得到米乳復(fù)合穩(wěn)定劑配方模型:

表6 穩(wěn)定劑復(fù)配均勻設(shè)計(jì)結(jié)果Table 6 Results of uniform design of stabilizer compounding

Y=238.3X2-28.18X1-56.52X3+253.9X4-2.10X1X2+1.68X1X3-2.32X1X4-1.68X2X3-9.84X2X4-1.92X3X4(R2=0.9977,F=436.46,p=0.000)

在回歸模型的基礎(chǔ)上,為得到最優(yōu)配方比例,根據(jù)約束條件進(jìn)行求解。

經(jīng)軟件(SAS 9.2)數(shù)據(jù)分析得知,當(dāng)海藻酸丙二醇酯、蔗糖脂肪酸酯、果膠、黃原膠比例分別為60.0%、0.2%、38.0%、1.8%時,米乳的離心沉淀率為2.02%。據(jù)此配比制備米乳,測定離心沉淀率為2.25%,與理論計(jì)算值較接近,表明該配比適宜。

2.4 米乳飲料的儲藏品質(zhì)

米乳飲料在4 ℃儲藏過程中滴定酸度和活菌數(shù)的變化情況如圖9所示,隨儲藏時間延長,米乳的滴定酸度呈上升趨勢,儲藏3 d時,米乳的滴定酸度無顯著變化(p>0.05),7 d后達(dá)到最高值(34.21 °T);活菌數(shù)呈先上升后下降趨勢,儲藏9 d時,米乳的活菌數(shù)顯著下降(p<0.05)。

圖9 4 ℃儲藏過程中米乳的品質(zhì)變化Fig.9 Quality changes of rice milk at 4 ℃storage conditions

米乳飲料在4 ℃儲藏過程的感官評價如表7所示,儲藏5 d時,口感略酸;儲藏7 d時,米乳的口感偏酸,雖有少許上清液析出,但整體體系感官接受度較高;儲藏9 d時,米乳的酸味略重,且分層現(xiàn)象嚴(yán)重,感官接受度較低。因此,米乳于4 ℃條件儲藏7 d可保持相對較好感官品質(zhì)。

表7 4 ℃條件儲藏過程中米乳飲料的感官評價Table 7 The sensory quality of rice milk at 4 ℃

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過研究商用酸奶發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ZSM-002在米乳中的發(fā)酵特性,確定將商用酸奶發(fā)酵劑和植物乳桿菌ZSM-002以3∶2復(fù)配作為米乳發(fā)酵的菌種,優(yōu)化的米乳飲料配方為:米水比1∶10 (g/mL)、3%的復(fù)合菌接種量、10%脫脂乳、9%白砂糖、0.2%復(fù)合穩(wěn)定劑(海藻酸丙二醇酯60%,蔗糖脂肪酸酯0.2%,果膠38%,黃原膠1.8%),37 ℃發(fā)酵10 h,此條件下制作的米乳飲料的滴定酸度為(17.03±0.92) °T,活菌數(shù)為(8.53±0.08)lg (cfu/mL),感官評分為(8.83±0.20)分,離心沉淀率為2.25%;在4 ℃條件下儲藏7 d后,其酸度為(34.2±1.56) °T,活菌數(shù)為(7.44±0.12)lg (cfu/mL),仍可保持相對較好的感官品質(zhì)。