低場核磁結(jié)合理化指標(biāo)分析低溫貯藏真空包裝牦牛肉的品質(zhì)

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(1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039;2.西華大學(xué)西華學(xué)院,四川成都 610039)

牦牛是我國青藏高原特有的物種,常年生長在海拔3000米以上的高寒地區(qū),抗寒能力強(qiáng),體質(zhì)粗壯結(jié)實[1]。牦牛肉富含蛋白質(zhì)(18%～22%),脂肪含量較低(2%～5%),還含有多種必需氨基酸和微量元素,其氨基酸模式有利于人體消化吸收[2]。我國境內(nèi)的牦牛大約有1300萬頭,占世界總量的95%以上[3]。雖然我國擁有大量的牦牛資源,但由于地域限制和肉品貯藏手段在各地區(qū)發(fā)展的不平衡,使得對牦牛肉貯藏技術(shù)和貯藏過程中水分變化的相關(guān)性研究的報道較少。李儒仁等[4]研究了凍藏對牦牛肉蛋白質(zhì)、脂質(zhì)氧化和保水性的影響。馬華麗等[5]研究了引起牦牛肉冷藏過程中變質(zhì)的原因,分析了感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)在牦牛肉冷藏過程中的變化規(guī)律。

真空包裝技術(shù)被廣泛用于肉類保鮮,但是,利用真空包裝技術(shù)保鮮牦牛肉的應(yīng)用和研究較少。白風(fēng)奎等[6]對真空包裝延長牦牛鮮肉貨架期進(jìn)行研究,通過單因素實驗與正交試驗得出,溫度是影響真空包裝牦牛肉貨架期的主要因素。低場核磁共振技術(shù)(Low Field Nuclear Magnetic Resonance,LF-NMR)是近年發(fā)展起來的一種快速、有效、無損的水分檢測技術(shù)[7]。利用低場核磁共振技術(shù),通過橫向馳豫時間可檢測肉中水分子的移動和分布狀態(tài),馳豫時間越長,表示水與大分子物質(zhì)之間的作用力越小[8]。國內(nèi)外許多學(xué)者利用低場核磁共振技術(shù)研究了雞肉[9]、豬肉[10]、鱈魚肌肉[11]等肉類的T2弛豫時間,可有效地反應(yīng)水分變化與肉品品質(zhì)變化之間的關(guān)系。

目前,應(yīng)用低場核磁技術(shù)研究真空包裝的牦牛肉品質(zhì)變化較少。本研究利用低場核磁共振技術(shù)監(jiān)測真空包裝牦牛肉在4 ℃冷藏條件下的水分變化,并將水分及含量變化與肉品品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,提供一種利用LF-NMR技術(shù)對冷藏牦牛肉進(jìn)行科學(xué)、無損的品質(zhì)監(jiān)測方法,為肉品品質(zhì)變化的機(jī)理研究及科學(xué)合理貯藏牦牛肉提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牦牛肉 當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場;氧化鎂、三氯乙酸、氯仿、乙二胺四乙酸(EDTA)、碘化鉀、磷酸鹽、硫酸銅、氫氧化鈉等 均為分析純,成都市科龍化工試劑廠;牛血清白蛋白(BSA) BR(生物試劑),上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;2-硫代巴比妥酸(TBA) 純度≥98.5%,上?？曝S實業(yè)有限公司。

MesoMR23-040V-1型低場核磁共振儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司;K9840型自動凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;SW-CJ-1FD型無菌工作臺 蘇凈安泰有限公司;Molecular Devices SpectraMax i3x型酶標(biāo)儀 美谷分子儀器(上海)有限公司;DHP-9052型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;XINGHE真空包裝機(jī) 諸城市興和機(jī)械有限公司;DK-98-Ⅱ型水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;TD-5M型離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛肉預(yù)處理 將新鮮牦牛肉剔除筋腱和脂肪,切分為5 cm×5 cm×2 cm,約50 g左右,利用真空包裝袋將牛肉包裝后抽真空放置于4 ℃冰箱中貯藏。在貯藏的第0、3、6、9、12、15、18 d天測定樣品的蛋白質(zhì)溶解度、揮發(fā)性鹽基氮、微生物菌落總數(shù)、硫代巴比妥酸值(TBARS)、T2橫向弛豫時間和蒸煮損失。

1.2.2 菌落總數(shù)的測定 參考GB4789.2-2016[12]的方法測定菌落總數(shù)。

1.2.3 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定 參照GB5009.228-2016[13]的方法,運用自動凱氏定氮儀法測定牦牛肉中TVB-N的含量。

1.2.4 硫代巴比妥酸值的測定 參照Marianne等[14]的方法。與TBA反應(yīng)的物質(zhì)的量(TBARS)測量結(jié)果以每100 g肉中丙二醛的mg數(shù)來表示。

TBARS(mg/100 g)=(A532-A600)/155×(1/10)×72.6×100

式中:A532:532 nm處所測的紫外吸光光度值;A600:600 nm處所測的紫外吸光光度值。

1.2.5 蛋白質(zhì)溶解度的測定 參照牛力[15]的方法,取1 g樣品切碎,加入pH=7.2的20 mL碘化鉀(1.1 mol/L)和磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L)的混合液,用漩渦震蕩儀震蕩均勻,于4 ℃冰箱中冷藏20 h。然后進(jìn)行離心,離心力2600×g,時間30 min,室溫。離心后取上清液1 mL,加入雙縮脲試劑A(0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液)3 mL,旋渦振蕩后再加入雙縮脲試劑B(0.01 g/mL的硫酸銅溶液)2滴,在37 ℃水浴鍋中加熱20 min。吸取200 μL樣液于96孔板中,用酶標(biāo)儀測得540 nm波長時肉樣的吸光值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:利用牛血清蛋白作對照,分別取濃度為2 mg/mL的牛血清蛋白0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL(牛血清蛋白質(zhì)量為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg)。向每只試管中加入蒸餾水至1 mL,加入雙縮脲試劑量和操作方法同上。以牛血清蛋白質(zhì)濃度作為橫坐標(biāo),以吸光度Abs的值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到方程y=0.0366x+0.0002,R2=0.9998。

1.2.6 蒸煮損失的測定 取10 g牦牛肉切成小塊,放于蒸煮袋中,在95 ℃的電熱恒溫水浴鍋內(nèi)加熱10 min,當(dāng)肉的中心溫度達(dá)到85 ℃時,取出樣品,冷卻至常溫,用濾紙擦干表面水分,然后稱量,以未處理的樣品為對照。蒸煮損失按下式計算:

蒸煮損失(%)=[(蒸煮前肉重-蒸煮后肉重)/蒸煮前肉重]×100

1.2.7 自旋-自旋弛豫時間(T2)的測定 準(zhǔn)確稱取樣品3 g,用濾紙擦拭干凈樣品表面水分,置于核磁樣品管中,而后放入磁體腔內(nèi),進(jìn)行核磁共振測定樣品中水分含量,不同貯藏時間的肉樣測定4個平行。首先在Q-FID序列下利用標(biāo)準(zhǔn)水膜進(jìn)行儀器的校正,采用90°和180°脈沖進(jìn)行校正,然后放入樣品,尋找樣品的最佳TW、NS參數(shù)值,最后選擇Q-CPMG序列進(jìn)行樣品的弛豫時間采集。測試條件:氫質(zhì)子共振頻率23 MHz,測定溫度(32±0.02) ℃,選擇Q-CPMG序列,采樣頻率(SW)=100 kHz,回波數(shù)(NECH)=3000,回波時間(TE)=1.00 ms,重復(fù)次數(shù)(NS)=2,等待時間(TW)=3700 ms,90 °脈寬(P1)=10.00 us,180°脈寬(P2)=20.00 us,采樣點數(shù)(TD)=150028,O1=940152.75,NMR測得的圖為自由誘導(dǎo)指數(shù)衰減曲線,通過儀器自帶的反演軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)反演,得到樣品中不同組分水分的弛豫時間與峰面積,最后對實驗結(jié)果進(jìn)行分析處理[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 22.0處理并進(jìn)行Dunacans差異顯著性分析和Pearson相關(guān)性分析,用Origin 8.6進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)的變化

由圖1可見,隨著冷藏時間的延長,牦牛肉中的菌落總數(shù)不斷增長。在前6 d微生物生長處于延滯期,因此增長相對比較緩慢,從第9 d開始進(jìn)入對數(shù)期,至第18 d增長迅速,且第15 d已達(dá)到7.15lg cfu/g。鮮肉腐敗主要受肉表面微生物的生長和繁殖的影響,微生物的生長和繁殖會引起肉感官品質(zhì)及理化品質(zhì)的下降,從而縮短鮮肉的貨架期[17-19]。經(jīng)過真空包裝的牦牛肉可以有效地隔絕肉與外界環(huán)境的接觸,減少氧氣含量,抑制需氧型微生物的生長繁殖,延長肉的貨架期。但是由于牦牛在宰殺后,在分割、儲運及銷售過程中極易受到微生物污染,導(dǎo)致牦牛肉表面的初始微生物數(shù)量增加。因此牦牛肉從市場運回實驗室,再經(jīng)過真空包裝,于4 ℃冷藏條件下貯藏,腐敗在很大程度上取決于肉品初期所帶初始腐敗菌的數(shù)量。

圖1 貯藏時間對牦牛肉中菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effect of storage time on the total number of colonies in vacuum-packaged yak beef

2.2 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的變化

由圖2可見,牦牛肉中TVB-N的含量隨貯藏時間的延長而增大,這是由貯藏過程中微生物的繁殖和生長分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨及胺類物質(zhì)而引起的,直接影響其新鮮度[20]。TVB-N在第12 d含量達(dá)到13.67 mg/100 g,第15 d時已達(dá)到21.37 mg/100 g,超過了國家標(biāo)準(zhǔn)GB2707-2016[21]“鮮(凍)畜、禽產(chǎn)品”衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(鮮肉的TVB-N≤15 mg/100 g)。

圖2 貯藏時間對牦牛肉中TVB-N含量的影響Fig.2 Effect of storage time on TVB-N contents in vacuum-packaged yak beef

2.3 硫代巴比妥酸值(TBARS)的變化

由圖3可見,隨著貯藏時間的延長,TBARS值不斷增加,當(dāng)貯藏到第15 d時,比初始值增加了0.103 mg/100 g。說明隨著貯藏時間的延長,牦牛肉中的脂肪發(fā)生氧化酸敗的程度增加。肉中脂肪發(fā)生氧化酸敗的原因可能是由于游離脂肪酸在冷藏過程中發(fā)生氧化生成醛、酮、酸等小分子物質(zhì),因此TBARS值呈增長趨勢[22]。真空包裝的牦牛肉中的脂肪在貯藏期間,受包裝袋內(nèi)殘留的氧氣、微生物和酶等因素的影響,脂肪會發(fā)生氧化反應(yīng),從而引起牦牛肉品質(zhì)的不斷下降。同時肌肉中蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)以及碳水化合物中的游離糖類都能夠加快氧化速率[23];除此之外,肌肉中的血紅蛋白和肌紅蛋白的降解產(chǎn)物原卟啉、血紅素同樣具有加快脂肪氧化速率的作用[24]。因此隨著冷藏時間的增長,肉品的氧化程度不斷加深,得到的TBARS值也就相應(yīng)增大。

圖3 貯藏時間對牦牛肉中TBARS含量的影響Fig.3 Effect of storage time on TBARS contents in vacuum-packaged yak beef

2.4 蛋白質(zhì)溶解度的變化

蛋白質(zhì)溶解度的降低是肉品質(zhì)下降的重要指標(biāo),因為肉中蛋白質(zhì)的加工特性和食用品質(zhì)只有在蛋白質(zhì)處于高溶解狀態(tài)下才能表現(xiàn)出來。從圖4可以看出,隨著冷藏時間的延長,蛋白質(zhì)溶解度不斷地減小,當(dāng)貯藏到第18 d時,比初始值降低了50.92%。這是由于牦牛肉貯藏過程中,蛋白質(zhì)的水合環(huán)境發(fā)生變化,破壞了維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力平衡,并且因為一些基團(tuán)的水化層被破壞,基團(tuán)間的相互作用引起蛋白質(zhì)的聚集或亞基重排,造成蛋白質(zhì)的變性,溶解度不斷地減小[25-26]。

圖4 貯藏時間對牦牛肉中蛋白質(zhì)溶解度的影響Fig.4 Effect of storage time on protein solubility in vacuum-packaged yak beef

2.5 蒸煮損失的變化

牦牛肉蒸煮損失的變化如圖5所示,0～3 d牦牛肉蒸煮損失迅速增加,3～12 d出現(xiàn)下降趨勢,12 d以后又出現(xiàn)小幅度上升,推測其原因可能是貯藏前期牦牛肉本身的自由水含量高,這部分水很容易損失。貯藏中期,由于自由水隨著時間的延長不斷滲出,因此蒸煮損出現(xiàn)下降趨勢。到貯藏后期由于微生物的作用和肌肉內(nèi)各種酶的降解作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大量解體,肌肉持水力下降,造成蒸煮損失的再次上升[27]。

圖5 貯藏時間對牦牛肉蒸煮損失的影響Fig.5 Effect of storage time on cooking loss of vacuum-packaged yak beef

2.6 水分及含量的變化

2.6.1 不同貯藏時間橫向弛豫時間T2的變化 圖6顯示的是經(jīng)過真空包裝的牦牛肉在貯藏過程中的NMR橫向弛豫時間T2的反演圖譜。從圖6中可以看出,肉樣在進(jìn)行NMR反演后的弛豫圖一共有4個峰,區(qū)間分別處于T21、T22(1～10 ms)、T23(10～100 ms)和T24(100～1000 ms)。四個峰的分界明顯,弛豫時間和峰面積各不相同,這可以反映肉中水分存在的三種狀態(tài),其中T21、T22(0～10 ms)表征結(jié)合水,與蛋白質(zhì)等有機(jī)大分子緊密結(jié)合,作用力強(qiáng),通常存在于肌纖維內(nèi)部,即使受肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、電荷變化、外力變化的影響,也不能改變其與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài),所以結(jié)合水對肌肉系水力影響很小[28]。T23(10～100 ms)表征不易流動水,存在于肌纖絲、肌原纖維及細(xì)胞膜之間的不易流動水占肉中水分含量的80%左右,在0 ℃以下結(jié)冰,且易受外力、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化等的影響,通常情況下肌肉的系水力主要由這部分水決定[29]。T24(100～1000 ms)表征的是存在于細(xì)胞間隙和結(jié)構(gòu)組織中的自由水。自由水是由物理吸附作用與肉結(jié)合,因此這部分水在貯藏過程中很容易流失[30]。由圖6可以看出,隨著貯藏時間的延長,T21、T22弛豫時間后移,但T21、T22峰面積總和減小的幅度較小。弛豫時間的變化說明在貯藏過程中結(jié)合水與大分子物質(zhì)之間作用力的強(qiáng)弱發(fā)生改變。T23、T24峰面積不斷減少,說明不易流動水和自由水隨著貯藏時間的延長不斷減少。

圖6 牦牛肉在貯藏過程中橫向弛豫時間分布Fig.6 Transverse relaxation time distribution of yak beef during different storage times

2.6.2 不同貯藏時間牦牛肉水分相對含量的變化 根據(jù)T2區(qū)間的積分面積可以估算氫質(zhì)子的相對含量。因此,可以用T21,T22,T23,T24峰積分面積來表示牦牛肉貯藏過程中水分含量的變化情況,即T21,T22,T23,T24質(zhì)子密度。不同時間貯藏下牦牛肉T2質(zhì)子密度變化見表1。T21,T22在整個貯藏過程中呈下降趨勢,說明結(jié)合水的相對含量隨著貯藏時間的延長有減小的趨勢。T23在整個貯藏過程中不斷減小,在第3 d以后減小幅度增大(p<0.05),這是由于不易流動水不斷地轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?從而不斷滲出,因此,T23質(zhì)子密度顯著下降(p<0.05)。同時可以看出,T24在貯藏過程中不斷減小,到第12 d以后幾乎檢測不到T24的信號。自由水是由物理吸附作用與肉結(jié)合,因此這部分水在貯藏過程中很容易流失[16]。

表1 不同貯藏時間牦牛肉T21、T22、T23、T24質(zhì)子密度變化Table 1 Change of T21,T22,T23,T24density of yak beef at different storage times

2.7 各指標(biāo)的相關(guān)性分析

將真空包裝4 ℃貯藏條件下牦牛肉弛豫特性與品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如表1所示。由表1不同品質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性可知,貯藏時間與TVB-N、菌落總數(shù)之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(p<0.01),與TBARS顯著正相關(guān)(p<0.05),與蛋白質(zhì)溶解度、T23、T24極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),表明肉的品質(zhì)指標(biāo)與貯藏時間之間有著顯著相關(guān)性。T21與菌落總數(shù)、TVB-N顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),與蛋白質(zhì)溶解度顯著正相關(guān)(p<0.05);T22與T24顯著正相關(guān)(p<0.05)。從相關(guān)性分析可以看出T21、T22與其他指標(biāo)間相關(guān)性不大,因為隨著貯藏時間的延長,T21、T22變化不顯著(p>0.05)。菌落總數(shù)與T23、T24、蛋白質(zhì)溶解度呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),與TVB-N、貯藏時間呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),與TBARS顯著正相關(guān)(p<0.05)。從相關(guān)性分析可以看出,肉中的不易流動水和自由水在貯藏過程中都能被微生物利用,隨著微生物的生長繁殖,肉中的蛋白質(zhì)被分解利用,產(chǎn)生氨及胺類物質(zhì)從而引起的TVB-N值的增加。TVB-N與TBARS、貯藏時間、菌落總數(shù)呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性(p<0.01),與蛋白質(zhì)溶解度、T23之間則呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),與T24顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)。

表2 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between various indicators

TBARS與貯藏時間、菌落總數(shù)、TVB-N之間均呈現(xiàn)出顯著或極顯著正相關(guān)(p<0.05或p<0.01),與蛋白質(zhì)溶解度顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)、與T23極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01)。蛋白質(zhì)溶解度與貯藏時間、菌落總數(shù)、TVB-N極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),與TBARS顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),與T23、T24極顯著正相關(guān)(p<0.01)。在肉的貯藏過程中,氧化反應(yīng)也在緩慢發(fā)生中,研究表明,肉中脂質(zhì)的氧化與蛋白質(zhì)的氧化之間可能存在著一定程度的相互作用,包括反應(yīng)產(chǎn)物之間的相互促進(jìn)作用[31-32]。隨著氧化過程的推進(jìn),形成的自由基與氨基酸側(cè)鏈發(fā)生羰基化反應(yīng),使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而引起蛋白質(zhì)溶解度下降[33]。因此在貯藏過程中,脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的活性基團(tuán)(如氫過氧自由基ROO·,·OO等基團(tuán))繼續(xù)與體系中的物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng),使得肉的品質(zhì)降低[34]。

對于水分來說,T23、T24與貯藏時間、TVB-N、TBARS、菌落總數(shù)之間顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),與蛋白質(zhì)溶解度之間顯著正相關(guān)(p<0.05)。T23與貯藏時間、TVB-N、TBARS、蛋白質(zhì)溶解度、菌落總數(shù)、T24之間極顯著相關(guān)(p<0.01)。T24與T23、貯藏時間、TVB-N、蛋白質(zhì)溶解度、菌落總數(shù)及蒸煮損失均呈現(xiàn)較好的相關(guān)性(p<0.05),這也說明了肉中不易流動水、自由水與肉的持水力、保水性、風(fēng)味等品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)[35-36]。從相關(guān)性分析可以看出牦牛肉在貯藏過程中,物理化學(xué)性質(zhì)的變化常伴隨著肉中水分子流動性的變化[8]。因此可利用T2弛豫時間進(jìn)行不同貯藏時間下牦牛肉品質(zhì)的評定。

3 結(jié)論

采用真空包裝的牦牛肉,隨著冷藏時間的延長,各品質(zhì)指標(biāo)與水分及含量都發(fā)生明顯變化,因此貯藏時間的控制對牦牛肉在冷藏過程中品質(zhì)變化的影響極為重要。利用低場核磁測得橫向弛豫時間T21、T22在貯藏過程中后移,含量減少;T23和T24在整個貯藏期內(nèi)含量不斷減小,變化顯著(p<0.05)且當(dāng)?shù)?2 d以后自由水大部分流失。通過相關(guān)性分析,T23、T24與貯藏時間、TVB-N、TBARS、菌落總數(shù)、蛋白質(zhì)溶解度之間顯著或極顯著相關(guān)(p<0.05或p<0.01)。因此,利用低場核磁共振技術(shù)對牦牛肉冷藏過程中T2橫向弛豫時間的變化可知,借助水分含量變化可對牦牛肉在貯藏過程中肉品質(zhì)的變化進(jìn)行判斷具有一定的可行性。分析水分變化與肉品品質(zhì)之間的關(guān)系,通過橫向弛豫時間T2和質(zhì)子密度變化可實現(xiàn)對真空包裝牦牛肉貯藏過程中的品質(zhì)監(jiān)測。

此外,本次實驗還存在不足之處,實驗過程中沒有測定肉的質(zhì)構(gòu)特性與水分變化的關(guān)系、自旋-晶格弛豫時間T1的變化、以及水分活度與水分變化之間的關(guān)系,后續(xù)將繼續(xù)深入研究水分變化對牦牛肉脂肪氧化、蛋白質(zhì)氧化以及質(zhì)構(gòu)特性的影響。