可手術(shù)胃癌和結(jié)直腸癌中血清TK1和Hepcidin表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

程 旭 陸 曄 仇慧珠 潘湘濤

細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶1(thymidine kinase 1,TK1)與細(xì)胞的增殖有關(guān)，在DNA的合成中將胸腺嘧啶核苷轉(zhuǎn)換為單磷酸胸腺嘧啶，是嘧啶補救合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[1-2]。近期有研究表明腫瘤細(xì)胞中高水平的TK1可以從細(xì)胞周期中的S期一直持續(xù)到M期，TK1的表達(dá)水平與DNA的合成具有一致性，在增殖細(xì)胞中水平升高[3]，提示TK1的表達(dá)水平可以作為腫瘤細(xì)胞生長、增殖的1種標(biāo)志物。我們既往的研究[4]表明Hepcidin是引起腫瘤等疾病中慢性病貧血的主要原因，并且在腫瘤組織中也有表達(dá)、并與T分期等有關(guān)[5]。因此，本研究應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測66例可手術(shù)的胃腸道腫瘤患者的血清TK1表達(dá)情況，同時應(yīng)用免疫組化方法檢測腫瘤組織中Hepcidin表達(dá)，以探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收治本院2016年1月至2017年9月期間手術(shù)切除的資料較為完整的66例患者，其中胃癌29例、結(jié)直腸癌37例。對其存檔蠟塊，均經(jīng)病理學(xué)檢查復(fù)查確診明確無誤，并且術(shù)前均未經(jīng)化療或放療。其中男性40例，女性26例，年齡23～82歲、中位年齡64歲。TNM分期符合全國胃癌協(xié)作組病理組規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。本組無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等晚期腫瘤病例。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化實驗 試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。采用SABC免疫組織化學(xué)染色法，所有石蠟標(biāo)本均進(jìn)行5 μm切片，連續(xù)切4張，置于600烤箱內(nèi)烤30 min；均分別予二甲苯脫蠟、無水酒精及其他不同濃度酒精脫蠟，自來水洗2 min水化。一張切片進(jìn)行HE染色復(fù)核病理診斷、其余四張SABC染色，按試劑盒的操作規(guī)程進(jìn)行。以PBS代替一抗做陰性對照。結(jié)果判斷以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞漿被染成棕黃色或黃褐色為陽性。 高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野，按照瘤細(xì)胞著色的深度計分,染色強(qiáng)度淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分。按照陽性細(xì)胞數(shù)記分,陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分;11%～25%為1分,26%～50%為2分;51%～75%為3分,75%以上為4分。兩個分值相乘,0分為陰性,記為(-)；1～4分為弱陽性,記為(+);5～8分為中度陽性(++),≥8分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.2.2 血清TK1測定 ①TK1試劑盒、GIS-1型化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像分析儀均購自華瑞同康生物技術(shù)(深圳)有限公司。所有研究工作均在本院腫瘤科實驗室完成?；颊呖崭钩檠? ml，30 min內(nèi)高速離心，取血清備用。制備抗體稀釋液、洗液、封閉液。將內(nèi)含硝酸纖維素膜的膜板平放在一張干凈的濾紙上，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品按1號、2號、3號的順序點樣到A1、A2、A3位置上，每孔3 μl；待測血清按每孔3 μl順序點后面的膜上，室溫下自然晾干。打開膜板，將膜放入反應(yīng)盒內(nèi)，用配置后的稀釋液振搖洗膜2次，每次5 min。棄去洗滌液，加封閉液，室溫下振搖封閉1 h。加一抗(TK1-IgY)，40 ℃下過夜。棄去反應(yīng)液，用洗液漂洗3次后，振搖洗滌3次，每次5 min。加二抗(生物素化抗IgY二抗)，室溫下振搖反應(yīng)40 min，棄去反應(yīng)液，用洗液漂洗3次后，振搖洗滌3次，每次5 min。加鏈酶親和素-酶復(fù)合物，室溫下振搖反應(yīng)1 h。棄去封閉液，用洗液漂洗3次后，振搖洗滌3次，每次5 min。加ECL發(fā)光試劑，過膜浸濕，精確反應(yīng)1 min。將膜放入CIS-1型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行分析。上述重復(fù)3次。取3次測量值均數(shù)，測量值波動范圍為均數(shù)±0.5 mg。②依據(jù)既往的大樣本臨床試驗研究數(shù)據(jù)確定的血清TK1的參考值，即血清TK1水平0～2.0 pmol/l為正常，>2.0 pmol/l為異常[6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，根據(jù)資料性質(zhì)應(yīng)用卡方檢驗，t檢驗，以及Spearman進(jìn)行等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 胃腸道腫瘤組織中Hepcidin表達(dá)情況

Hepcidin在癌旁正常胃黏膜組織中陽性表達(dá)率為20.0%(3/15)，胃腸道腫瘤組織中其陽性表達(dá)率為62.1%(41/66)，差異具有顯著性(χ2=8.74，P<0.01)。Hepcidin表達(dá)與年齡、T分期和脈管浸潤有關(guān)(P<0.05，0.01和0.01)，而與性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、Her-2表達(dá)和有無貧血均無相關(guān)性(P均>0.05)。具體結(jié)果見表1。

2.2 術(shù)前血清TK1表達(dá)與其臨床病理特點的關(guān)系

總陽性表達(dá)6例，陽性率9.09%。其中37例腸癌患者TK1陽性3例、陰性34例，而29例胃癌患者TK1陽性3例、陰性26例，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.10，P>0.05)。考慮到胃癌和腸癌兩者之間TK1的表達(dá)無明顯差異，同時鑒于本組資料相對偏少，因此將兩者合并后再進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。研究結(jié)果表明血清TK1的表達(dá)水平與患者性別、分化程度、Her-2表達(dá)有關(guān)，而與年齡、T分期、脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無貧血之間均無相關(guān)性。胃癌、結(jié)直腸癌患者血清TK1表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系見表1。

2.3 Hepcidin表達(dá)與血清TK1與Ki-67、Hb水平關(guān)系

腫瘤組織中Hepcidin表達(dá)與血清TK1與Ki-67、Hb水平的關(guān)系見表2。腫瘤組織中Hepcidin表達(dá)與Ki-67是相關(guān)的，而與Hb水平無相關(guān)關(guān)系；同樣血清TK1表達(dá)與Ki-67相關(guān)，而與Hb水平無相關(guān)關(guān)系。

表1 腫瘤組織中Hepcidin和血清TK1表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系

注:*為P<0.05,**為P<0.01,余均為P>0.05。

表2 腫瘤組織中Hepcidin和血清TK1表達(dá)與Ki-67、Hb水平的關(guān)系

注:*為P<0.05,**為P<0.01,余均為P>0.05。

將腫瘤組織Hepcidin的表達(dá)與血清中TK1表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果提示腫瘤組織Hepcidin的表達(dá)與血清中TK1表達(dá)兩者之間并無直接的相關(guān)關(guān)系，γ=-0.1005，P>0.05。

3 討論

我們的研究結(jié)果表明腫瘤組織中高表達(dá)Hepcidin，并且兩者均與患者的年齡、T分期、Ki-67水平和脈管浸潤相關(guān)；但與患者的性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、Her-2表達(dá)和有無貧血均無相關(guān)關(guān)系。這與文獻(xiàn)結(jié)果基本一致，如Ward等[7]的研究表明腸癌患者高表達(dá)Hepcidin；Kamai等[8]的研究提示腎癌患者腫瘤組織中hepcidin mRNA的表達(dá)可能與組織分化及腫瘤的分期無關(guān)。Pinnix等[9]的研究則表明乳腺癌患者高表達(dá)Hepcidin mRNA。因此，結(jié)合本研究結(jié)果和文獻(xiàn)結(jié)果可以認(rèn)為在胃腸道腫瘤組織中Hepcidin的表達(dá)和腫瘤的局部浸潤有關(guān)。上述結(jié)果與我們既往的研究結(jié)果是一致的[5]。但由于本研究中無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等晚期病例，對于該類患者的情況有待于進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

近期有研究[10-11]表明食道癌、胃癌、結(jié)直腸癌等患者的血清TK1的陽性率明顯高于正常對照組[13]，并且TK1在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，預(yù)示著預(yù)后不良[12]。表明TK1能夠表示腫瘤細(xì)胞的增殖程度、因而可以判斷腫瘤的惡性程度，進(jìn)而可以判斷腫瘤的治療效果和預(yù)后。本文TK1陽性率為9.09%(6/66)，低于霍穎等[13]TK1在結(jié)腸癌中的陽性率59.21%，我們分析認(rèn)為本研究中均是能夠可以手術(shù)的病例，沒有轉(zhuǎn)移等Ⅳ期晚期患者，可能影響了TK1的陽性率。同時我們也發(fā)現(xiàn)TK1表達(dá)與患者的T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等均無相關(guān)關(guān)系，與劉昕等[14]TK1在胃癌、結(jié)腸癌和肺癌等中隨著分期有增高趨勢不相一致，與黃志宇等[12]在晚期非小細(xì)胞肺癌中與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)的結(jié)果一致、但與其TMN分期有關(guān)的結(jié)果不一致。我們分析產(chǎn)生上述差異的原因是在于選擇的病種及其病情程度(即分期等)有關(guān)不完全相同有關(guān)，比如劉昕等[14]文章中包含了肺癌等病例，而黃志宇等[12]基本為晚期病例，他們應(yīng)用的是TMN分期，包括了很多有轉(zhuǎn)移在內(nèi)的Ⅳ期患者，而我們的研究中都為能夠手術(shù)的病例、無晚期病例，并且我們應(yīng)用的T分期。當(dāng)然也不排除我們的病例數(shù)不太多也有影響，對于確切的原因，有待于進(jìn)一步深入研究。另外，TK1的表達(dá)與患者的性別、Her-2的表達(dá)和Ki-67的水平相關(guān)，至今有關(guān)這方面的報道尚不多見。目前較多的意見認(rèn)為Her-2是胃癌的獨立的不良預(yù)后因素，雖然在腸癌中的研究略少，但基本的研究結(jié)果與在胃癌中的結(jié)果是相似的。Ki-67則是1個普遍認(rèn)為的惡性腫瘤患者的惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)，即Ki-67越高則惡性程度越高、預(yù)后越差。因此，我們認(rèn)為本研究中TK1的表達(dá)結(jié)果與Her-2、Ki-67表達(dá)的結(jié)果是一致而并不矛盾的的。

我們發(fā)現(xiàn)患者腫瘤組織中的Hepcidin表達(dá)與血清中的TK1水平不相關(guān)(γ=-0.1005，P>0.05)。但是腫瘤組織中的Hepcidin表達(dá)與年齡、T分期、脈管浸潤和Ki-67相關(guān)，而血清TK1則與性別、Her-2表達(dá)，分化程度和Ki-67相關(guān)。兩者之間的關(guān)系正好是互補關(guān)系，提示聯(lián)合檢測腫瘤組織中的Hepcidin表達(dá)與血清中的TK1的水平，可以更好地判斷患者的病情惡性程度、判斷預(yù)后，從而指導(dǎo)臨床更合理地選擇治療方案以取得較好的治療效果。

總之，對于可手術(shù)的胃癌和結(jié)直腸癌患者聯(lián)合檢測腫瘤組織中的Hepcidin表達(dá)與血清中的TK1的水平是有一定意義的，值得進(jìn)一步深入研究、進(jìn)一步探索。