鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)量的相關(guān)性分析

李 俊

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)東南部發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一[1]，世界衛(wèi)生組織2012年發(fā)布數(shù)據(jù)顯示鼻咽癌患病率約為1.2/10萬(wàn)，而我國(guó)鼻咽癌患病率為1.9/10萬(wàn)，每年因鼻咽癌死亡人數(shù)占全球鼻咽癌死亡人數(shù)的40.14%[2]。臨床治療該病的主要手段以外科根治術(shù)與放化療結(jié)合，患者治療后5年生存率在68.79%左右[3]，大部分患者死亡原因主要為術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[4]。而環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是近年來(lái)研究熱門的腫瘤相關(guān)因子之一，研究發(fā)現(xiàn)COX-2可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)腫瘤血管生成而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移[5]；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通過(guò)加快血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化從而起到促進(jìn)血管新生，在許多類腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)該因子異常表達(dá)[6]；磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(Phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA)則被證實(shí)為一種宮頸原癌基因，但隨著對(duì)PIK3CA的深入研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌、直腸癌等多種腫瘤組織中均有PIK3CA異常表達(dá)[7]。本研究通過(guò)探究鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)情況，分析三者間相互關(guān)系，并結(jié)合患者臨床資料探究上述指標(biāo)對(duì)鼻咽癌發(fā)生發(fā)生的影響及臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取我院2014年1月至2014年12月收治確診為鼻咽癌患者34例作為研究對(duì)象，入選條件：①入院時(shí)均經(jīng)血液學(xué)、醫(yī)學(xué)影像學(xué)以及組織活檢確診為鼻咽癌，且病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌；②活檢標(biāo)本均為放射性治療前采集的；③所有患者均簽署知情同意書，且術(shù)后3年隨訪完整，剔除失聯(lián)病例。34例患者中，男性27例，女性7例，年齡28～76歲，平均年齡(57.89±21.55)歲，臨床分期情況：Ⅰ期6例、Ⅱ期10例、Ⅲ期9例、Ⅳ期9例。所有患者均行腫瘤根治術(shù)且術(shù)后根據(jù)個(gè)體實(shí)際情況行2～4個(gè)周期放化療及輔助化療治療。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗人PIK3CA單克隆抗體選購(gòu)于Abnova公司；兔抗人環(huán)氧化酶-2多克隆抗體購(gòu)自SATA，兔抗人VEGF多克隆抗體購(gòu)自中山金橋，DAB試劑盒、馬抗小鼠HRP二抗、山羊抗兔HRP二抗選購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 活檢所取標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定后采用石蠟常規(guī)包埋呈3 μm厚的組織切片，收集所有患者組織切片后，采用常規(guī)免疫組化S-P法按照所購(gòu)試劑說(shuō)明書進(jìn)行。一抗由PBS緩沖液代替作為以上染色的陰性對(duì)照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 VEGF、COX-2、PIK3CA陽(yáng)性表達(dá)的判定依據(jù)主要為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核出現(xiàn)著色，利用裝有目鏡網(wǎng)格微側(cè)尺于200倍視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)5個(gè)網(wǎng)格中的蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性的腫瘤細(xì)胞數(shù)予以計(jì)數(shù)，根據(jù)所有腫瘤細(xì)胞總數(shù)中不同蛋白陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞占的百分率，對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的劃分，主要?jiǎng)澐謽?biāo)準(zhǔn)為視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%則為陽(yáng)性(+)，<10%則為陰性(-)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0對(duì)本實(shí)驗(yàn)所采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VEGF、COX-2、PIK3CA表達(dá)之間關(guān)系采用Searson相關(guān)性分析方法進(jìn)行分析，生存率用Kaplan-Meier法計(jì)算，VEGF、COX-2、PIK3CA不同表達(dá)組別的生存率關(guān)系用Log-rank檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)情況與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系

鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)陽(yáng)性率與患者性別、年齡均無(wú)顯著相關(guān)，而COX-2表達(dá)陽(yáng)性率與患者是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者腫瘤臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05)；VEGF、PIK3CA表達(dá)陽(yáng)性率與腫瘤臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)系(P<0.05)，結(jié)果如表1所示。

2.2 鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)的相關(guān)性分析

34例鼻咽癌患者腫瘤組織中，VEGF表達(dá)為陽(yáng)性的有25例，陽(yáng)性率為73.53%；COX-2表達(dá)為陽(yáng)性的有23例，陽(yáng)性率為67.65%；PIK3CA表達(dá)為陽(yáng)性的有25例，陽(yáng)性率為73.53%，三者間陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過(guò)Pearson相關(guān)性分析鼻咽癌組織中的VEGF蛋白、COX-2蛋白表達(dá)量與PIK3CA蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)前二者與后者明顯存在正相關(guān)關(guān)系(γ=0.808、γ=0.643，P均<0.05)。

2.3 鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性

鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)為陽(yáng)性或陰性患者治療后第1年內(nèi)存活率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后3年，鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)為陽(yáng)性患者的生存率明顯低于陰性表達(dá)患者(P<0.05)。見表2。

表1 鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)情況與患者臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

表2 鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性(例，%)

3 討論

鼻咽癌是一種起源于鼻咽黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)病地區(qū)主要集中于廣東、廣西、湖南、福建和江西5個(gè)省份[8]，而鼻咽癌發(fā)病病因并不完全清楚，目前主要認(rèn)為有基因遺傳因素、EB病毒感染、環(huán)境污染、長(zhǎng)期接觸刺激性化學(xué)致癌因素等等[9]。鼻咽癌發(fā)病部位較為隱蔽且與顱底緊密相連，故鼻咽癌發(fā)病時(shí)極易侵犯顱底、頸動(dòng)脈鞘區(qū)及咽旁間隙等周圍組織結(jié)構(gòu)[10]，這給外科切除手術(shù)增加了難度。外科手術(shù)為了避開或與重要器官安全切緣往往難以完全切除腫瘤，這也是患者術(shù)后多出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而影響預(yù)后的重要原因之一[11]。但根治術(shù)后結(jié)合放化療可有效提高患者生存率，但放化療治療周期長(zhǎng)，過(guò)程副作用多，部分患者難以堅(jiān)持[12]。本研究通過(guò)探究鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)情況，分析三者間相互關(guān)系，并結(jié)合患者臨床資料探究上述指標(biāo)對(duì)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的影響及與患者預(yù)后情況的相關(guān)性。

結(jié)果顯示鼻咽癌患者腫瘤組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)陽(yáng)性率與患者性別、年齡均無(wú)顯著相關(guān)，而COX-2表達(dá)陽(yáng)性率與患者是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者腫瘤臨床分期無(wú)關(guān)，說(shuō)明COX-2與患者腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)聯(lián)，COX-2是機(jī)體內(nèi)前列腺素合成過(guò)程中一個(gè)重要的限速酶，而前列腺素具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增生以及刺激新生血管生成等多種作用[13]。Zhu等[14]將104例低分化鱗癌NPC分為COX-2高表達(dá)組和COX-2低表達(dá)組，探討COX-2在低分化鼻咽癌中的表達(dá)及與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者COX-2比例明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，多因素logistic回歸分析顯示COX-2高表達(dá)是鼻咽癌復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。另一方面，VEGF、PIK3CA表達(dá)陽(yáng)性率與腫瘤臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)系。VEGF是一種可以增加血管通透性、促進(jìn)血管新生、引起淋巴管內(nèi)皮增生的因子[15]，研究發(fā)現(xiàn)VEGF可能改變?cè)泻托律牧馨凸軆?nèi)皮的通透性，以及腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16]。PIK3CA是近年來(lái)研究熱門的多種腫瘤相關(guān)原癌基因之一。Phipps等[17]研究發(fā)現(xiàn)10%～20%的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中出現(xiàn)PIK3CA突變；Scheffler等[18]亦發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中PIK3CA基因異常活化后導(dǎo)致體細(xì)胞突變；Ma等[19]采用雙重PI3K-mTOR抑制劑BEZ235在體外對(duì)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)該抑制劑可通過(guò)抑制AKT和mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)G1期阻滯和細(xì)胞凋亡；Yip等[20]通過(guò)對(duì)74例鼻咽癌患者腫瘤組織中PI3Kp110α和PIK3CA基因擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中PIK3CA基因的拷貝數(shù)明顯高于非惡性鼻咽組織中的，提示PIK3CA基因異?；钴S導(dǎo)致正常細(xì)胞PI3Kp110α過(guò)度表達(dá)而導(dǎo)致鼻咽癌的發(fā)病。通過(guò)分析患者術(shù)后3年隨訪資料發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)為陽(yáng)性或陰性患者治療后第1年內(nèi)存活率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療后3年，鼻咽癌組織中VEGF、COX-2與PIK3CA表達(dá)為陽(yáng)性患者的生存率明顯低于陰性表達(dá)患者的，說(shuō)明上述3種因子均可預(yù)測(cè)患者術(shù)后長(zhǎng)期生存情況，并且有可能可以根據(jù)這是3種因子的表達(dá)情況制定相應(yīng)的術(shù)后放化療方案，避免不必要的醫(yī)療浪費(fèi)。但本實(shí)驗(yàn)所能選取實(shí)驗(yàn)案例較少，該預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性仍需進(jìn)一步加大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

由于上述3種指標(biāo)在患者腫瘤組織中表達(dá)情況類似，且作用的方式也有異同之處，故我們猜想這三者存在某種生理病理學(xué)聯(lián)系，通過(guò)Pearson相關(guān)性分析鼻咽癌組織中的VEGF蛋白、COX-2蛋白表達(dá)量與PIK3CA蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)前二者與后者明顯存在正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明這三種作用因子可相互影響、相互作用，共同導(dǎo)致鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展，但應(yīng)進(jìn)一步對(duì)這三者生理病理聯(lián)系進(jìn)行深入探究。