miRNA調(diào)控EMT機制對鼻咽癌細胞侵襲及遷移的影響

孫瑜寧 張美麗 張恩東

鼻咽癌是1種在我國較常見的發(fā)生于鼻咽上皮的嚴重影響人身體健康的惡性腫瘤，發(fā)病率居各種常發(fā)惡性腫瘤第10位，死亡率居常發(fā)各種惡性腫瘤第9位[1]。鼻咽癌的發(fā)病原因多樣，目前國內(nèi)外的醫(yī)學工作者尚未給出明確的發(fā)病機制，腫瘤細胞的增值、侵襲和轉(zhuǎn)移是1個多步驟、多因素的過程，可能與人們的生活環(huán)境、生活習慣等有著密切的關系[2-3]。miRNA是1種長約18～24個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，其作用機制是通過與多個靶基因的不完全互補配對，通過轉(zhuǎn)錄作用抑制基因的表達[4-5]。在鼻咽癌的發(fā)展過程中，多個miRNA參與了腫瘤細胞的增殖、侵襲、分化、轉(zhuǎn)移等，嚴重影響患者的預后。EMT是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，是腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的1種生物學過程。為更深入分析了解miRNA調(diào)控EMT機制對鼻咽癌細胞侵襲及遷移的影響，本次采取控制單一變量方法進行研究分析，為診斷治療鼻咽癌提供新的依據(jù)，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取自2013年5月至2017年5月本科室接診的226例患者為研究對象，確診為鼻咽癌并在本科室實施治療的患者158例，非鼻咽癌患者68例。患者年齡為35～75歲，平均年齡(57.7±8.6)歲。各組患者的年齡、身高、體重和病程等臨床資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 各組一般臨床資料比較

1.2 樣本納入排除標準

納入標準：確診患者為鼻咽癌患者[6]；患者未患有影響本次研究的其他疾病；入本院之前未進行放療、化療、激素等治療；同意參加本次研究。

排除標準：患者診斷、治療等病歷資料不全者；手術之前經(jīng)評估腫瘤無法完整切除的患者；無法參與研究的；中途退出研究的。

1.3 研究方法

應用細胞劃痕實驗檢測鼻咽癌患者和非鼻咽癌患者鼻咽癌細胞的遷移能力，使用上海蒲拓光電儀器有限公司生產(chǎn)的XS-10B型號倒置光學顯微鏡觀察腫瘤細胞形態(tài)，應用MTT法檢測鼻咽癌和非鼻咽癌患者鼻咽癌細胞HNE1/DDP、HNE1針對不同濃度的順鉑(簡稱DDP，德州德藥制藥有限公司生產(chǎn))濃度表達水平。使用miRNA芯片技術檢測鼻咽癌細胞HNE1中miRNA的表達水平，采用熒光定量RT-PCR法檢測mRNA的水平，所有操作均由具有10年以上經(jīng)驗的醫(yī)師進行。

1.4 觀察指標

觀察記錄患者的姓名、年齡、身高、體重、病程、腫瘤大小等基本信息，密切觀察患者病情變化，記錄患者手術過程中出現(xiàn)的不良反應、手術時間等情況，及時監(jiān)測患者生化指標，記錄患者治療效果和患者滿意度等指標。

1.5 統(tǒng)計方法

應用SPSS 18.0(Statistical Product and Service Solutions 18.0，統(tǒng)計產(chǎn)品與服務解決方案)軟件對采集到的數(shù)據(jù)資料作統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 順鉑對患者鼻咽癌細胞增殖能力的影響

兩組患者HNE1/DDP濃度分別為(28.59±0.92)μmol/l、(15.23±0.83)μmol/l，HNE1濃度分別為(5.36±0.35)μmol/l、(4.02±0.23)μmol/l，鼻咽癌患者明顯高于非鼻咽癌患者，鼻咽癌患者耐藥指數(shù)4.37，低于非鼻咽癌患者的5.68，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 鼻咽癌細胞的侵襲和遷徙情況

使用細胞劃痕實驗觀察患者的腫瘤細胞的侵襲和遷移情況，鼻咽癌患者的腫瘤細胞HNE1/DDP的遷移距離為1.1 mm，HNE1為0.4 mm，HNE1/DDP的侵襲距離為2.1 mm，HNE1為1.2 mm，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 患者發(fā)生EMT情況

使用顯微鏡觀察腫瘤細胞的形態(tài)，采用RT-PCR法檢測細胞標記物情況，檢測結果顯示：HNE1細胞中間質(zhì)標志分子的表達水平1.1，明顯低于HNE1/DDP水平12.3，中上皮標志分子表達水平0.86，明顯高于HNE1/DD水平0.23。HNE1細胞轉(zhuǎn)錄因子snail等水平明顯低于HNE1/DDP水平，這即說明HNE1/DDP細胞相對于HNE1細胞發(fā)生了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 鼻咽癌細胞中miRNA的表達水平

HNE1/DDP細胞相比于HNE1細胞有8個miRNA表達下調(diào)和17個miRNA表達上調(diào)(|LogFC|>2，F(xiàn)C為fold chagne的簡稱)，其中mir-10b-5p最具差異表達miRNA，其表達上調(diào)達到15倍，見表2。

表2 鼻咽癌細胞中miRNA表達情況

3 討論

近年來，我國癌癥發(fā)病人數(shù)及發(fā)病速度均在不斷增多和加快[7-9]。癌癥已經(jīng)成為嚴重影響和制約我國人民身體素質(zhì)發(fā)展的重要因素。影響癌癥發(fā)展的主要有腫瘤細胞分化程度、腫瘤細胞浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移程度等[10-11]。及早發(fā)現(xiàn)，及早治療，是能有效治療和控制癌癥的最為有效的方法[12]。但是，一般情況下，癌癥病人發(fā)現(xiàn)患病即為癌癥中晚期，給治療帶來極大困難。尤其是鼻咽癌，前期發(fā)現(xiàn)較難，患者一般在偶然檢查中發(fā)現(xiàn)，給患者及家屬帶來巨大的精神壓力和經(jīng)濟負擔[13]。能盡快而且很方便的診斷癌癥已是廣大醫(yī)護人員和患者的最大呼聲。近幾年，大量的醫(yī)護人員通過檢測miRNA在鼻咽癌組織中表達水平來診斷分析鼻咽癌及研究癌細胞的遷移變化[14]。順鉑是1種治療鼻咽癌較為有效的非特異性抗腫瘤藥物，在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤細胞耐藥與腫瘤細胞發(fā)生EMT密切相關，會導致腫瘤細胞的侵襲和遷移。隨著科學技術和醫(yī)學水平的發(fā)展和提高，人們對癌癥的認識正在逐步加深。

本次研究表明，患者的身高、體重、年齡、病程等分布差異無統(tǒng)計學意義，對鼻咽癌細胞的分化、遷移等影響不明顯。兩組患者HNE1/DDP濃度分別為28.59±0.92、15.23±0.83，HNE1濃度分別為5.36±0.35、4.02±0.23，鼻咽癌患者明顯高于非鼻咽癌患者，鼻咽癌患者耐藥指數(shù)4.37，低于非鼻咽癌患者的5.68。使用細胞劃痕實驗觀察患者的腫瘤細胞的侵襲和遷移情況，鼻咽癌患者的腫瘤細胞HNE1/DDP的遷移距離為1.1 mm，HNE1為0.4 mm，HNE1/DDP的侵襲距離為2.1 mm，HNE1為1.2 mm。使用顯微鏡觀察腫瘤細胞的形態(tài)，使用RT-PCR法檢測細胞標記物情況，檢測結果顯示：HNE1細胞中間質(zhì)標志分子的表達水平1.1，明顯低于HNE1/DDP水平12.3，中上皮標志分子表達水平0.86，明顯高于HNE1/DD水平0.23。HNE1細胞轉(zhuǎn)錄因子snail等水平明顯低于HNE1/DDP水平，這即說明HNE1/DDP細胞相對于HNE1細胞發(fā)生了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。miRNA通過調(diào)控靶基因的表達，來影響腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、遷移和死亡，而且與腫瘤細胞的耐藥性密切相關，HNE1/DDP細胞相比于HNE1細胞有8個miRNA表達下調(diào)和17個miRNA表達上調(diào)，其中mir-10b-5p最具差異表達miRNA，其表達上調(diào)達到15倍。這和國內(nèi)部分專家的研究結果基本一致[15-16]。

綜上所述，miRNA在鼻咽癌腫瘤細胞中差異化表達，在EMT和順鉑耐藥性中起重要作用，mir-10b-5p促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，引發(fā)EMT的發(fā)生，為研究和治療鼻咽癌提供科學依據(jù)，為鼻咽癌患者提供準確的治療時機，給患者及家屬減輕精神和經(jīng)濟負擔，同時，為廣大醫(yī)護人員積累了經(jīng)驗，可廣泛推廣應用。