ZNF217在肝細胞癌中的表達及對腫瘤侵襲的影響

姜業(yè)臻 李 超 王宇峰 涂康生 劉青光

我國是世界上原發(fā)性肝癌發(fā)生率及死亡率最高的國家之一[1]，其中主要的病理類型為肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[2]。高侵襲性導(dǎo)致的腫瘤腹腔播散及多器官轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致HCC患者總體生存率較低的主要原因[3]。

在哺乳動物細胞內(nèi)具有大量含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，盡管這些轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸序列相似，但每種轉(zhuǎn)錄因子卻具有獨特的蛋白構(gòu)象及生物學(xué)功能[4]。鋅指蛋白217(zinc finger protein 217，ZNF217)是1種位于細胞核內(nèi)的kruppel樣鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，其表達水平在結(jié)腸癌[5]及卵巢癌[6]中均出現(xiàn)異常升高，并與腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲特征密切相關(guān)，提示ZNF217可能是1種新的腫瘤標(biāo)志物及分子治療靶點。本課題旨在通過檢測ZNF217在肝癌組織中的表達，分析其與患者腫瘤臨床特征之間的關(guān)系以及對肝癌細胞侵襲能力的影響及其分子機制，以期為研究ZNF217作為抗HCC侵襲轉(zhuǎn)移治療靶點提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于我院肝膽外科標(biāo)本庫整理收集在2013年1月1日至2015年1月1日間行手術(shù)切除的HCC及癌旁組織標(biāo)本50例，包括男性38例，女性12例，患者年齡50～71歲，中位年齡56歲。鼠抗人SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司。人永生化肝細胞LO2及肝癌細胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721及MHCC97-H均由我實驗室保存。鼠抗人ZNF217單克隆抗體(NBP2-46424)購自美國Novus公司；鼠抗人GAPDH(#5174)、E-cadherin(#14472)單克隆抗體及兔抗人Vimentin(#5741)單克隆抗體均購自美國CST公司。DMEM液體培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司。RNA提取試劑Trizol(#15596026)、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000(#L3000015)及RT-PCR試劑盒(#10928042)均購自美國Invitrogen公司。SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(#1725120)購自美國BIO-RAD公司。Transwell小室(#3458)購自美國CORNING公司。人工基質(zhì)膠(#354230)購自美國B&D公司。ZNF217引物(上游5'-ATGTTACTCCTCCTCCGGATG-3'；下游5'-ACACTTGGCCTGTATCTCA-3')，GAPDH引物(上游5'-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3'；下游5'-GGACTCCACGACGTACTCA-3')由上海生工生物工程公司合成。ZNF217 siRNA(sc-63249)及陰性對照siRNA購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 福爾馬林液固定-石蠟包埋的組織切片常規(guī)脫蠟、水化及微波抗原修復(fù)，分別用3%過氧化氫及10%山羊血清封閉切片。用鼠抗人ZNF217抗體按1∶100稀釋比例浸沒組織標(biāo)本，4 ℃搖晃、孵育過夜。洗凈未結(jié)合一抗后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗結(jié)合相應(yīng)一抗，DAB法顯示陽性蛋白。按如下方法計算切片染色得分：無陽性染色細胞為0分，陽性染色細胞數(shù)<25%為1分，25～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及qRT-PCR 人永生化肝細胞LO2及肝癌細胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721及MHCC97-H培養(yǎng)于適宜環(huán)境中，穩(wěn)定傳代2～3代。按Trizol說明書指示提取細胞總RNA。每樣本取等量RNA配制20 μl的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA。cDNA稀釋10倍后取5 μl配制Real-time PCR體系，按如下條件進行PCR反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，擴增40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算ZNF217 mRNA的相對表達量。

1.2.3 細胞siRNA轉(zhuǎn)染 MHCC97-H細胞以過夜培養(yǎng)達50%～70%之密度接種于6孔板中。ZNF217 siRNA轉(zhuǎn)染分組：陰性對照組(si-Control)每孔加入75 pmol的陰性對照siRNA及7.5 μl轉(zhuǎn)染試劑，ZNF217組每孔加入75 pmol的ZNF217 siRNA及7.5 μl轉(zhuǎn)染試劑；以無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整終體積為2 ml/孔。轉(zhuǎn)染48 h后進行下一步試驗。

1.2.4 Transwell侵襲小室模型 用無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶8比例稀釋50 mg/l的基質(zhì)膠100 μl/孔覆蓋transwell小室上室面，于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)風(fēng)干1 h后備用。取轉(zhuǎn)染48 h后的MHCC97-H細胞用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，以2×105/ml的密度每孔加入100 μl的細胞懸液。24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入750 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將小室放于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS清洗小室、4%多聚甲醛固定，并用0.1%的結(jié)晶紫染色10 min。擦除上室面未成功侵襲過小室膜的細胞，顯微鏡下觀察并計數(shù)下室面細胞數(shù)目。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測 MHCC97-H細胞轉(zhuǎn)染72 h后，以RIPA裂解細胞，提取細胞總蛋白并均值化每樣本蛋白量。4%～20% SDS-PAGE凝膠每孔加入15 μl蛋白樣品，垂直電泳分離蛋白。100 V轉(zhuǎn)膜2 h之條件將目的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。5% BSA室溫封閉1 h后按1∶1 000比例4 ℃孵育ZNF217、E-cadherin、Vimentin及GAPDH一抗過夜。PBS洗去未結(jié)合一抗后采用1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗室溫孵育NC膜1 h。于暗室內(nèi)，ECL法觀察蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ZNF217在肝癌組織中的表達情況

經(jīng)免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，ZNF217主要表達于細胞核及細胞質(zhì)中。統(tǒng)計學(xué)分析表明，HCC組織中的ZNF217的免疫組化評分(2.53±0.31)顯著高于癌旁組織評分(1.03±0.33)(P=0.007)。

2.2 肝癌中ZNF217表達與其臨床病理特征的關(guān)系

50例HCC患者分為ZNF217高表達組(n=32)和ZNF217低表達組(n=18)。高表達ZNF217患者其臨床TNM分期較低表達ZNF217的患者更晚(χ2=5.223，P=0.022)，見表1。

表1 ZNF217表達與肝癌臨床特征的相關(guān)性/例

注：*為P<0.05。

2.3 siRNA沉默MHCC97-H細胞中ZNF217表達

以LO2中ZNF217 mRNA的表達水平標(biāo)準(zhǔn)化4種肝癌細胞中ZNF217 mRNA的表達水平后發(fā)現(xiàn)，除HepG2細胞外，ZNF217 mRNA在其余3種肝癌細胞中的水平均顯著高于LO2細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1A)。向ZNF217 mRNA表達量最高的MHCC97-H細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染入ZNF217特異性siRNA。qRT-PCR及蛋白免疫印跡檢測結(jié)果證實，siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)了MHCC97-H細胞中ZNF217 mRNA(1.00 vs 0.31±0.10，P=0.008，圖1B)及蛋白(0.61±0.11 vs 0.17±0.09，P=0.030，圖1C)的表達水平，成功建立了肝癌細胞ZNF217敲除模型。

2.4 下調(diào)ZNF217的表達抑制MHCC97-H細胞侵襲及EMT現(xiàn)象

如圖2A所示，下調(diào)ZNF217表達后，侵襲至小室下室面的細胞數(shù)目較對照組明顯減少[(48.81±7.11)vs (17.42±8.02)，P=0.024，圖2B)]。上皮-間質(zhì)化轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細胞侵襲能力發(fā)生變化的眾多分子機制之一。如圖2B所示，沉默ZNF217后MHCC97-H細胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達水平顯著提高[(0.31±0.07) vs (0.78±0.11)，P=0.039)]，而Vimentin表達水平顯著降低[(0.39±0.05)vs (0.09±0.05)，P=0.011)]。

A為不同肝癌細胞中ZNF217 mRNA相對表達量；B為siRNA沉默MHCC97-H細胞內(nèi)ZNF217 mRNA的表達；C為siRNA沉默MHCC97-H細胞內(nèi)ZNF217蛋白的表達。

A為沉默ZNF217抑制MHCC97-H細胞的侵襲數(shù)目；B為沉默ZNF217對MHCC97-H細胞內(nèi)E-cadherin及Vimentin表達的影響。

3 討論

ZNF217位于人類染色體20q13區(qū)域，這一區(qū)域的基因在人類腫瘤中常常出現(xiàn)異常擴增[7]。目前研究結(jié)果[8]也表明，ZNF217也是1種具有促癌作用的蛋白，并且在不同的腫瘤類型中存在異常表達并具有多樣化的生物學(xué)功能。

首先，ZNF217在包括乳腺癌[9]和前列腺癌[10]在內(nèi)的多種腫瘤中的表達異常升高，且高表達ZNF217的患者手術(shù)后或者化療后的無病生存率和總生存率較低表達ZNF217的患者更低。在本研究中，我們通過檢測50例肝細胞癌組織中ZNF217的表達水平顯著高于癌旁組織，高表達ZNF217的患者臨床分期(TNM分期)更晚，提示這部分患者預(yù)后不良。但是，由于長期隨訪未完成，我們暫不能得出肝癌組織中ZNF217的表達與患者臨床預(yù)后間的確切關(guān)系，這需要在今后的研究工作中進一步完善。

其次，有證據(jù)表明，在卵巢癌[11]及乳腺癌[12]中，ZNF217能夠通過持續(xù)激活PI3K/Akt及MAPK信號通路維持腫瘤細胞的增殖狀態(tài)。除此之外，ZNF217還能通過與CoREST形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物來阻滯細胞周期抑制因子p15ink4b的轉(zhuǎn)錄，從而使更多的腫瘤細胞處于DNA復(fù)制的S期[13]。但是，ZNF217對于腫瘤細胞侵襲及EMT形成的作用尚不完全明確。在本研究中，我們通過小RNA干擾技術(shù)在肝癌細胞中下調(diào)ZNF217的表達后，通過transwell侵襲小室模型證實MHCC97-H細胞的侵襲能力受到抑制，創(chuàng)新性的證明了沉默ZNF217表達能夠發(fā)揮一定的抗腫瘤侵襲作用。上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是改變腫瘤細胞侵襲能力的重要分子機制之一[14]。目前已確證，Snail、Slug及TWIST等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子均能夠促進肝癌細胞EMT現(xiàn)象的發(fā)生，而這些轉(zhuǎn)錄因子與ZNF217相似，均具有鋅指結(jié)構(gòu)[15]。在本研究中，我們通過蛋白免疫印跡檢測證實，在下調(diào)ZNF217后，MHCC97-H細胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達顯著升高而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達顯著下調(diào)。因此，我們推測ZNF217促進肝癌細胞侵襲可能是通過促進肝癌細胞EMT而實現(xiàn)的。

綜上，ZNF217在肝癌組織中表達異常升高，其作為一種癌蛋白，在促進腫瘤侵襲方面具有重要作用。