姜黃素對過度訓(xùn)練致大鼠脾臟細胞凋亡的調(diào)控作用及其機制*

周海濤，曹建民，胡 戈，張 靜，郭 嫻，牛衍龍，王安琪，杜 堃，魏江山，關(guān)云鵬，邵芙蓉，趙 卓△

(1. 北京聯(lián)合大學(xué)，北京 100023；2. 北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191；3. 北京體育大學(xué)，北京 100084；4. 贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

脾臟作為機體最大的免疫器官，是機體細胞/體液免疫的中心。長時程、大強度運動引發(fā)的過度訓(xùn)練不僅會使機體出現(xiàn)明顯的疲勞感和免疫力低下，甚至還會造成脾臟結(jié)構(gòu)及功能損傷，細胞凋亡加劇是其重要原因之一[1]。氧化應(yīng)激則是誘導(dǎo)臟器細胞凋亡加劇的主要影響因素[2]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)可通過調(diào)控下游多種抗氧化酶的基因表達，緩解和改善氧化應(yīng)激對機體的影響和損傷。同時，Nrf2通過與B淋巴細胞瘤因子-2(B cell lymphoma-2 protein，Bcl-2)抗氧化反應(yīng)元件的結(jié)合，調(diào)控抗/促凋亡蛋白表達，抑制和延緩細胞凋亡[3]。本課題組前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可有效地緩解氧化應(yīng)激[4]，抑制和延緩過度訓(xùn)練引發(fā)的過度細胞凋亡和運動性臟器損傷，保護臟器組織結(jié)構(gòu)和功能正常[5-6]。本實驗結(jié)合前期研究，通過觀察各組大鼠脾臟臟組織形態(tài)，計算脾臟系數(shù)，結(jié)合脾臟組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、細胞凋亡及Keap1-Nrf2-ARE信號通路相關(guān)蛋白表達水平變化，探討姜黃素通過調(diào)控Keap1-Nrf2-ARE信號通路在緩解大鼠過度訓(xùn)練所致氧化應(yīng)激及脾臟細胞過度凋亡、保護脾臟的作用機制，為姜黃素在運動營養(yǎng)領(lǐng)域的深度應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

63只SPF級雄性Wistar大鼠(49 d齡，218.4±10.7 g)，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部(生產(chǎn)合格證編號 SCXK(京) 2016-0010)。北京體育大學(xué)SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，溫度20～24 ℃，相對濕度55%～75%，正常晝夜節(jié)律。4 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后進行3 d適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，20 min/d，有3只大鼠無法完成適應(yīng)性訓(xùn)練，剔除后將剩余大鼠隨機分為安靜對照組(C組，n=12)、過度訓(xùn)練組(OM組，n=24)和姜黃素+過度訓(xùn)練組(COM組，n=24)。

1.2 訓(xùn)練方案與干預(yù)

OM、COM組采用8周遞增負荷游泳訓(xùn)練，具體方案[7]見圖1。訓(xùn)練過程中，若發(fā)現(xiàn)大鼠下沉不能自主上浮，計時10 s后迅速托出水面，休息5～10 min，然后繼續(xù)訓(xùn)練直至完成訓(xùn)練方案。

姜黃素(純度≥99%)購自陜西源泰生物科技公司(批號17012571)，使用0.5%羧甲基纖維素納作為助溶劑，配制姜黃素混懸液，4℃存放備用。C組常規(guī)飼養(yǎng)，不進行任何運動干預(yù)。根據(jù)文獻[8]及預(yù)實驗結(jié)果，COM組大鼠姜黃素干預(yù)劑量為200 mg/(kg·d)，灌胃體積為5 ml/kg；其他組灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素納。8周訓(xùn)練期間，每天采用專業(yè)灌胃器在訓(xùn)練前1 h灌胃1次。

Fig. 1 Swimming training program of rats

Note: swimming time (min) × load percentage of the body weight (body weight %) × frequency of training

1.3 實驗動物取材

受運動量、負重、恢復(fù)時間等多種因素影響，游泳訓(xùn)練中易出現(xiàn)大鼠意外死亡現(xiàn)象。本研究中，全部訓(xùn)練結(jié)束后OM、COM組大鼠分別剩余11只和14只。末次訓(xùn)練結(jié)束后24 h對大鼠進行稱重，乙醚麻醉后頸總動脈取血，室溫自然凝固，待血清出現(xiàn)后4℃3 000 r/min，離心10 min，分離血清，-20℃凍存待測血清睪酮(testosterone，T)和皮質(zhì)酮(corticosterone，Cor)。無菌環(huán)境下，迅速取脾臟，剝離周圍脂肪組織，置于預(yù)冷的生理鹽水中沖洗，濾紙吸去多余液體后稱重以計算脾臟指數(shù)。切取1 cm×0.5 cm×0.2 cm脾臟組織浸入4%多聚甲醛常溫固定待觀察脾臟組織病理變化和檢測脾臟組織細胞凋亡水平、Nrf-2、血紅素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)、Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)蛋白表達水平；另取0.3 g左右脾臟組織，準(zhǔn)確稱量重量后按照組織塊重量W(g)/勻漿介質(zhì)V(ml)為1/9的比例加入PBS緩沖液，以玻璃勻漿器在冰上充分研磨后進行超聲破碎，5 000 r/min離心5 min，取上清待測脾臟組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度。

1.4 指標(biāo)測試方法

嚴格按照試劑盒說明書對各指標(biāo)進行測試和計算。使用儀器包括Allegra 25R臺式高速離心機(美國Beckman Coulter公司)，Wellscan MK3酶標(biāo)儀(美國雷博公司)，Pannoramic MIDI全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(匈牙利3D HISTECH公司)，r-911全自動放免計數(shù)儀(中國科技大學(xué)實業(yè)總公司)，722分光光度計(上海分析儀器三廠)，NR-B17CC超低溫冰箱(日本松下電器)，ISO9001電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，DK-2000-Ⅲ L型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，LEICA RM2016病理切片機(德國RM公司)。

1.4.1 脾臟指數(shù)計算 脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)×100 %

1.4.2 脾臟病理變化評價 取出固定液中的脾臟組織，經(jīng)過洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋后，制成4 μm切片，HE染色，在400倍光鏡下，觀察脾臟組織病理變化。

1.4.3 脾臟細胞凋亡檢測 采用Tunel法檢測細胞凋亡。石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)修復(fù)、破膜后，將適量末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、脫氧尿苷三磷酸按2∶29比例混合，覆蓋組織。切片平放于濕盒內(nèi)，37℃ 孵育2 h后加入3 %過氧化氫溶液，室溫避光孵育15 min。適量converter-POD 37℃孵育30 min。洗滌，二氨基聯(lián)苯胺顯色，Harris蘇木素染色液復(fù)染細胞核后脫水封片。試劑盒由瑞士Roche公司提供。

1.4.4 蛋白免疫組化分析 采用免疫組化法檢測Nrf-2、HO-1、Bcl-2、Bax表達情況。石蠟切片脫蠟至水經(jīng)抗原修復(fù)后，加入3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min后脫色洗滌3次進行血清封閉，隨后加入一抗、二抗，進行二氨基聯(lián)苯胺顯色，Harris蘇木素復(fù)染細胞核后脫水封片?？贵w由武漢谷歌生物科技有限公司提供。

1.4.5 H-score評分方法 采用病理切片掃描儀將每張切片內(nèi)陽性細胞數(shù)量及其染色強度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)數(shù)值，應(yīng)用公式計算H-score。整張切片經(jīng)過全視野數(shù)字掃描，根據(jù)細胞核顏色，將每個組織點的染色強度轉(zhuǎn)化為像素面積并計算陽性百分比，深棕色、棕黃色、淺黃色和藍色依次判定為強陽性、中度陽性、弱陽性和陰性。H-score=(弱陽性細胞密度×1)+(中陽性細胞密度×2)+(強陽性細胞密度×3)，計算后進行組間評定。

1.4.6 其他指標(biāo)測試方法 采用放射免疫法測定血清T、Cor，酶聯(lián)免疫吸附法測定脾臟組織SOD活性、MDA濃度。以上試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血清睪酮/皮質(zhì)酮比較

血清T濃度，與C組相比，OM組呈現(xiàn)極顯著降低(P<0.01)；與OM組相比，COM組呈現(xiàn)極顯著升高(P<0.01)。血清Cor濃度，與C組相比，OM組呈現(xiàn)顯著升高(P<0.01)；與OM組相比，COM組呈現(xiàn)極顯著降低(P<0.01)。組間T/Cor與T變化趨勢一致(表1)，OM組、COM組較C組下降86.33%和47.24%。

GroupnT(ng/ml)Cor(ng/ml)T/Cor(10-2)C121.82±0.7123.81±3.918.34±4.37OM110.50±0.12??45.95±6.93??1.14±0.44??COM141.22±0.66##30.11±8.41##4.40±4.26##

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group；T: Testosterone; Cor: Corticosterone

**P<0.01vsC group;##P<0.01vsOM group

2.2 三組大鼠體重及脾臟指數(shù)比較

8周末大鼠體重(表2)，與C組相比，OM組呈現(xiàn)顯著性變化(P<0.05)，COM組與OM組間無顯著差異。脾臟指數(shù)，與C組相比，OM組呈現(xiàn)極顯著性降低(P<0.01)；與OM組相比，COM組呈現(xiàn)顯著性升高(P<0.05)。

Groupn Body weight(g)Spleen indexC12522.26±57.431.92±0.24OM11390.67±14.53??1.50±0.23??COM14397.47±24.361.84±0.27#

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group

**P<0.01vsC group;#P<0.05vsOM group

2.3 三組大鼠脾臟組織形態(tài)比較

光鏡下觀察顯示(圖2，見彩圖頁Ⅰ)，C組大鼠脾臟組織形態(tài)正常，被膜、小梁及紅、白髓結(jié)構(gòu)完整，界限清晰。白髓淋巴細胞豐富，生發(fā)中心明顯。脾小體與脾竇結(jié)構(gòu)完整、清晰可見，脾竇未見充血、擴張。OM組大鼠脾臟組織形態(tài)改變明顯，紅、白髓間交界模糊不清。淋巴細胞出現(xiàn)腫脹、細胞間間隙狹窄。血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)腫脹，內(nèi)皮疏松、脫落，同時出現(xiàn)疑似淀粉樣變性、髓外造血灶及少量色素沉積。COM組大鼠脾臟組織形態(tài)損傷程度較OM組明顯改善，紅、白髓間交界清晰程度有明顯改善，鏡下未見淀粉樣變性、髓外造血灶及色素沉積。

2.4 三組大鼠脾臟組織細胞凋亡水平比較

脾臟組織細胞凋亡水平，與C組相比，OM組凋亡加劇(P<0.01)；與OM組相比，COM組得到有效緩解(P<0.05)。脾臟組織Bcl-2表達，與C組相比，OM組下調(diào)顯著(P<0.05)；與OM組相比，COM組上調(diào)顯著(P<0.05)；Bax表達，與C組相比，OM組上調(diào)顯著(P<0.05)；與OM組相比，COM組下調(diào)顯著(P<0.05)。各組之間Bcl-2/Bax與Bcl-2表達變化趨勢一致(表3，圖3，圖4，見彩圖頁Ⅰ)。

2.5 三組大鼠脾臟組織Nrf-2/HO-1表達水平及氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

脾臟組織Nrf2表達水平，與C組相比，OM組出現(xiàn)下調(diào)，但無顯著差異(P>0.05)；與OM組相比，COM組上調(diào)顯著(P<0.05)；HO-1表達水平，與C組相比，OM組下調(diào)顯著(P<0.05)；與OM組相比，COM組上調(diào)極為顯著(P<0.01，表4，圖5，見彩圖頁Ⅰ)。脾臟組織SOD活性，與C組相比，OM組呈現(xiàn)極顯著降低(P<0.01)；與OM組相比，COM組呈現(xiàn)顯著升高(P<0.05)；MDA濃度，與C組相比，OM組呈現(xiàn)極顯著升高(P<0.01)；與OM組相比，COM組呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05，表4)。

3 討論

機體通過有效地識別“自己”與“異己”成分，破壞和排斥以各種方式和途徑進入體內(nèi)的抗原物質(zhì)，以及自身產(chǎn)生的各種損傷細胞和腫瘤細胞，充分發(fā)揮免疫機能以提高健康水平。適宜的運動有助于人體提高自身免疫機能、生活質(zhì)量和健康水平已成為共識。但相關(guān)研究表明過度的運動訓(xùn)練易對免疫機能造成強烈的負面影響，不僅會使機體出現(xiàn)免疫抑制和免疫力低下，甚至對免疫系統(tǒng)特別是人體最大的免疫器官-脾臟造成功能和結(jié)構(gòu)損傷[1,9]。

血清T/Cor比值是評價和診斷過度訓(xùn)練的金標(biāo)準(zhǔn)。OM組大鼠血清T/Cor比值較C組下降高達86.33%，大幅超過現(xiàn)有相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，說明本研究所采用的8周遞增負荷游泳訓(xùn)練方案成功的建立了過度訓(xùn)練動物模型。體重是評價運動訓(xùn)練負荷量和強度對機體的影響程度以及機體對訓(xùn)練的適應(yīng)情況。脾臟指數(shù)在反映脾臟發(fā)育情況的同時也可以間接的反映機體免疫水平[1]。本研究中OM組大鼠由于8周遞增負荷游泳訓(xùn)練引發(fā)過度訓(xùn)練，體重及脾臟指數(shù)較C組出現(xiàn)極顯著降低。這一結(jié)果與王雪芹[1]等人之前研究結(jié)果相一致。同時HE染色后光鏡下病理診斷發(fā)現(xiàn)OM組大鼠脾臟組織較C組發(fā)生了明顯的病理學(xué)改變。Nrf2可以作用重要調(diào)節(jié)中樞，可以在機體氧化應(yīng)激反應(yīng)中準(zhǔn)確、有效地調(diào)控抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達[11]。HO-1作為Nrf2下游重要的抗氧化蛋白，在應(yīng)激狀態(tài)下可以廣泛地參與Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)答過程[12]。本團隊前期研究成果充分證實氧化應(yīng)激所致細胞凋亡是過度訓(xùn)練所致臟器損傷主要發(fā)生機制之一[5-6,13]。Bcl-2與Bax間的比值變化在細胞凋亡的變化趨勢中發(fā)揮重要作用[14]。本研究中與C組比較，OM組大鼠脾臟組織Nrf2表達水平雖有降低，但未出現(xiàn)顯著性變化，SOD活性及HO-1、Bcl-2表達水平、Bcl-2/Bax比值呈現(xiàn)顯著性降低，MDA濃度、Bax表達及細胞凋亡水平呈現(xiàn)顯著升高。以上相關(guān)實驗結(jié)果說明8周遞增負荷游泳訓(xùn)練因運動訓(xùn)練負荷量與強度過大，應(yīng)激強度超過大鼠自身調(diào)節(jié)能力，誘發(fā)大鼠機體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，大鼠出現(xiàn)過度訓(xùn)練綜合癥及免疫損傷。同時脾臟細胞凋亡加劇引發(fā)脾臟組織功能、結(jié)構(gòu)損傷。其機制可能為，過度訓(xùn)練所致氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇引發(fā)脾臟組織中Nrf2異位和ARE結(jié)構(gòu)損傷，Keap1-Nrf2-ARE信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)受到影響，抗氧化能力下降，自由基代謝平衡被打破，大量的自由基無法有效清除[9]。

Tab. 3 H-score of spleen apoptosis and Bcl-2/Bax in spleen tissues of each group

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group；Bcl-2: B cell lymphoma-2 protein; Bax: Bcl-2 associated X protein

*P<0.05,**P<0.01vsC group;#P<0.05vsOM group

Tab. 4 H-score of Nrf2 and HO-1, SOD activity and MDA concentration in spleen tissue of each group

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group；Nrf2: Nuclear factor erythroid 2-related factor 2; HO-1: Heme oxygenase-1; SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde

*P<0.05,**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsOM group

本研究中，與OM組相比，COM組大鼠血清T/C比值呈現(xiàn)顯著升高(但較C組下降仍達 47.24%)，脾臟組織SOD活性及Nrf2、HO-1、Bcl-2表達、Bcl-2/Bax比值呈現(xiàn)顯著增強；脾臟組織細胞凋亡水平、Bax表達、MDA濃度顯著下降；脾臟組織形態(tài)明顯改善；體重有所升高，但未呈現(xiàn)顯著差異。上述實驗結(jié)果充分說明了在訓(xùn)練過程中對大鼠進行一定劑量姜黃素干預(yù)，可以在一定程度上有效地通過延緩過度訓(xùn)練所致氧化應(yīng)激，抑制大鼠脾臟細胞凋亡的發(fā)生，保護脾臟組織的功能和結(jié)構(gòu)。其機制可能為，Nrf2表達水平的變化，可以直接影響細胞凋亡過程[13,15]。姜黃素中的酚羰基可以與Keap1中半胱氨酸殘基上的巰基發(fā)生加成反應(yīng)，促使Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，推動Nrf2的核轉(zhuǎn)位[16]，增強Nrf2與ARE的結(jié)合，誘導(dǎo)HO-1表達增加[17]，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)進而影響細胞凋亡過程[18]。

綜上所述，8周遞增負荷游泳訓(xùn)練引發(fā)大鼠過度訓(xùn)練體內(nèi)氧化應(yīng)激加劇并出現(xiàn)，脾臟細胞凋亡加劇，脾臟組織發(fā)生病理改變及功能異常。訓(xùn)練期間給予姜黃素可以通過調(diào)控Keap1-Nrf2-ARE信號通路，在一定程度上有效緩解過度訓(xùn)練引發(fā)的氧化應(yīng)激，抑制大鼠脾臟細胞過度凋亡，保護脾臟組織的功能和結(jié)構(gòu)，預(yù)防和延緩免疫損傷。