海馬齒狀回神經(jīng)再生對(duì)WKY大鼠抑郁樣行為的影響*

陳 玲，馬近騰，常鑫蕊，馮 俐，楊小榮

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生理學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

抑郁癥是指持續(xù)超過(guò)兩周，不能自控的以情緒低落、快感缺失、意志活動(dòng)和認(rèn)知功能減退以及思維遲緩為主要特征的情感性精神障礙。據(jù)2017年統(tǒng)計(jì)全球抑郁癥患者高達(dá)3.22億，占世界人口的 4.4%[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示20%的中國(guó)人存在抑郁癥狀，其中僅有不足10%患者得到正規(guī)治療[2]。

目前臨床上廣泛使用的一線傳統(tǒng)抗抑郁藥主要是通過(guò)增加單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺的濃度發(fā)揮抗抑郁效果。然而患者在服用這類抗抑郁藥雖然數(shù)小時(shí)內(nèi)腦內(nèi)的單胺遞質(zhì)水平顯著增高，但其抑郁情緒在服藥后的3～4周才得到有效改善[3]。已知神經(jīng)干細(xì)胞從增殖、分化、成熟、再到整合到現(xiàn)有神經(jīng)環(huán)路中發(fā)揮其作用大約需要4周的時(shí)間[4]，由此可見(jiàn)神經(jīng)再生所需時(shí)間與抗抑郁藥發(fā)揮臨床療效具有相同的時(shí)程性。由此推斷從神經(jīng)再生的角度進(jìn)行深入研究或許能找到抑郁癥發(fā)病的核心機(jī)制。

中樞的側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ)和海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)顆粒下層區(qū)(subgranular zone, SGZ)是目前較為公認(rèn)的兩個(gè)存在有神經(jīng)前體細(xì)胞、具有神經(jīng)再生潛能的區(qū)域[5]。近年來(lái)有研究表明，成年海馬神經(jīng)再生及其調(diào)控會(huì)對(duì)抑郁癥發(fā)病和抗抑郁治療產(chǎn)生顯著影響，提出海馬神經(jīng)再生障礙可能成為抑郁癥形成的重要病理機(jī)制之一[3, 6, 7]。但也有部分研究者并不認(rèn)同抑郁癥的神經(jīng)再生障礙假說(shuō)，例如在一項(xiàng)臨床研究中并未觀察到抑郁癥患者海馬區(qū)成年神經(jīng)干細(xì)胞的增殖減少，且抗抑郁藥對(duì)情緒的改善作用并不依賴于神經(jīng)再生[8, 9]。因此，關(guān)于神經(jīng)再生在抑郁癥中的作用尚存在爭(zhēng)議。

Wistar Kyoto(WKY)大鼠作為Wistar大鼠品種的近交系，因其表現(xiàn)出高水平的內(nèi)源性抑郁樣行為[10-12]，而被作為抑郁癥的動(dòng)物模型廣泛使用。我們首先應(yīng)用免疫組織熒光染色方法觀察WKY抑郁大鼠的海馬神經(jīng)再生情況，并通過(guò)促進(jìn)海馬的神經(jīng)再生進(jìn)一步觀察對(duì)大鼠抑郁樣行為的影響，為探討神經(jīng)再生在抑郁癥中的重要作用提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

9周齡雄性Wistar大鼠(10只)和WKY大鼠(20只)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)SCXK(京)2016-0011。阿米替林(amitriptyline, AMI)購(gòu)自Sigma公司；兔免疫熒光Ki67一抗購(gòu)自Abcam公司；兔免疫熒光DCX(doublecortin, 微管相關(guān)蛋白)一抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔熒光二抗購(gòu)自中杉金橋公司；山羊血清購(gòu)自Life Sciences公司；DAPI購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

大鼠適應(yīng)環(huán)境一周后，分為3個(gè)組(n= 10)：(1)正常對(duì)照(Wistar)組：選取9 周齡雄性Wistar大鼠，給與生理鹽水 3 周；(2)抑郁模型(WKY)組：選取同齡雄性WKY大鼠并經(jīng)行為學(xué)測(cè)定后篩選出抑郁大鼠作為抑郁模型組，給予生理鹽水 3 周；(3)陽(yáng)性對(duì)照(AMI+WKY)組：選取同齡雄性WKY大鼠，給予阿米替林 3 周。將生理鹽水(10 mg/kg)或阿米替林溶液(10 mg/kg)灌胃給藥 21 d。行為測(cè)試在 09:00-15:00 進(jìn)行。糖水偏好實(shí)驗(yàn)(sucrose preference test, SPT)在給藥的第16～18日進(jìn)行，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test, OFT)在第 19 日進(jìn)行，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test, FST)在第 20～21 日進(jìn)行。在第 22 日處死大鼠，然后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

1.3.1 灌注大鼠 使用4%水合氯醛(1 ml/100 g)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉。4℃生理鹽水 500 ml心臟快速灌注，隨后先快后慢灌注 4℃ 4%多聚甲醛 300 ml。斷頭取腦后，在 4℃ 4%多聚甲醛下后固定 4 h，15%和30%蔗糖濃度梯度分別脫水。用OCT包埋劑包埋腦組織，在冰凍切片機(jī)下進(jìn)行冰凍切片，留取含海馬層面的切片(30 μm厚)。

1.3.2 免疫熒光染色 根據(jù)隔六取一的原則，每組取 6 張切片分別進(jìn)行Ki67免疫熒光染色和DCX免疫熒光染色。具體步驟如下：將大鼠腦片在37℃干燥箱 30 min烘干；隨后使用0.3% Triton PBS洗兩次，每次5 min，0.01 mol/L PBS洗一次，每次5 min；將腦片浸泡在丙酮內(nèi)，-20℃下保存 20 min；晾干后再洗三次；之后用10%山羊血清37℃封閉 1 h；加入兔源Ki67(1∶200)或DCX(1∶200)一抗，4℃過(guò)夜；洗三次后熒光二抗抗兔594(1∶100)37℃孵育 2 h；DAPI室溫孵育 10 min；PBS洗一次，每次5 min；用抗熒光衰減封片劑封片。在Olympus顯微鏡(BX51)下觀察海馬DG區(qū)染色結(jié)果并拍照，每次隨機(jī)選取DG區(qū) 5 個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算 6 張切片的平均值。

1.4 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

在給藥的第16日開(kāi)始糖水適應(yīng)，給予大鼠一瓶1%蔗糖(200 ml)和一瓶純水(200 ml)適應(yīng) 1 d，每 12 h調(diào)換一次水瓶位置。第 17 日大鼠開(kāi)始禁食禁水 23 h。隨后給予大鼠一瓶1%蔗糖和一瓶純水正式測(cè)試 1 h，每 30 min調(diào)換一次水瓶位置。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，記錄總消耗的蔗糖溶液和純水的量，并通過(guò)下式計(jì)算糖水偏好百分比：糖水偏好百分比=總蔗糖溶液消耗量/(總水消耗量+總蔗糖溶液消耗量)×100%[13]。

1.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

OFT裝置長(zhǎng) 50 cm，寬 50 cm，高 50 cm，其中底部設(shè)置成 25 宮格。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠置于曠場(chǎng)底部的中心以自由活動(dòng) 5 min，并使用安裝在曠場(chǎng)上方的攝像機(jī)記錄總距離和中心時(shí)間。每次測(cè)試記錄后，用70%乙醇清潔曠場(chǎng)底部和四壁[14]。

1.6 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

第1日的預(yù)訓(xùn)練期 15 min，將每只大鼠置于透明的有機(jī)玻璃圓筒(直徑 20 cm×高 44.5 cm)中，水溫24～26℃，水位以大鼠直立時(shí)剛不觸及水底為準(zhǔn)。第2日正式測(cè)試 5 min。在完成測(cè)試后，擦干大鼠體表，然后放回籠中。對(duì)測(cè)試時(shí)段進(jìn)行錄像并測(cè)量 5 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間[15]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 海馬的神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況 如圖1A所示為3組大鼠海馬DG區(qū)的Ki67+染色的代表性免疫熒光圖片。與正常對(duì)照組(10.9±1.9)相比，WKY抑郁大鼠海馬DG區(qū)Ki67+細(xì)胞數(shù)量(7.3±1.0)降低了33.0%(P<0.01)；而阿米替林給藥后使海馬DG區(qū)Ki67+細(xì)胞數(shù)量(10.5±1.6)較抑郁組(7.3±1.0)增加了43.8%(P<0.01，圖1B)。以上結(jié)果提示成年抑郁大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力降低，阿米替林可以促進(jìn)成年抑郁大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。

2.1.2 海馬的神經(jīng)干細(xì)胞分化情況 如圖2A所示為各組大鼠海馬DG區(qū)DCX+染色的代表性免疫熒光圖片。與正常對(duì)照組(136.0±21.6)相比，WKY抑郁大鼠海馬DG區(qū)DCX+細(xì)胞數(shù)量(82.7±11.7)降低了39.2%(P<0.01)；而阿米替林給藥后使海馬DG區(qū)的DCX+細(xì)胞數(shù)量(121.3±20.9)較抑郁組(82.7±11.7)增加了46.7%(P<0.01，圖2B)。以上結(jié)果提示成年抑郁大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力降低，阿米替林可以明顯增加成年抑郁大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力。

Fig. 1 The proliferating cells in hippocampal DG region in different groups (Immunofluorescence ×100)

**PvsWistar group;##PvsWKY group

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果如表1所示：與正常對(duì)照組相比，抑郁模型組大鼠糖水偏好百分比明顯降低(P<0.01)；而阿米替林給藥后使抑郁大鼠的糖水偏好百分比顯著升高(P<0.01，表1)。以上結(jié)果提示W(wǎng)KY大鼠出現(xiàn)快感缺乏癥狀，阿米替林可以改善WKY大鼠的快感缺乏癥狀。

2.2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，抑郁模型組大鼠在曠場(chǎng)中水平運(yùn)動(dòng)的總距離更短(P< 0.01),并且停留在中心的時(shí)間更短(P<0.01)；而阿米替林給藥后使抑郁大鼠的水平運(yùn)動(dòng)總距離顯著增加(P<0.01)，并使其中心停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P< 0.05，表1)。以上結(jié)果提示W(wǎng)KY大鼠的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)能力降低，并且對(duì)陌生環(huán)境的探索能力降低；阿米替林可以增加抑郁大鼠的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)能力和探索能力。

Fig. 2 The immature neurons in hippocampal DG region in different groups (Immunofluorescence ×100)

**PvsWistar group;##PvsWKY group

2.2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，抑郁組大鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；而給予阿米替林干預(yù)后，大鼠的不動(dòng)時(shí)間較抑郁組明顯縮短(P<0.05，表1)。以上結(jié)果表明WKY大鼠出現(xiàn)絕望行為，阿米替林可以改善抑郁大鼠的絕望行為。

3 討論

抑郁癥已成為危害人類健康最主要的疾病之一，目前臨床上治療抑郁癥的方法主要包括藥物治療、心理治療和物理治療。(1)一線的抗抑郁藥：主要包括選擇性的5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑，但這些藥物起效慢(一般2～4周)，緩解率低(只有67%)[16]，臨床療效不理想。(2)心理療法：包括認(rèn)知行為療法和人際關(guān)系療法。一般作為抑郁癥藥物治療的輔助療法，不單獨(dú)使用[17]。(3)物理療法：主要包括電休克治療或經(jīng)顱磁刺激治療，但其復(fù)發(fā)率高并可能誘發(fā)癲癇[18]?？梢?jiàn)，目前臨床上對(duì)于抑郁癥的治療效果并不理想，尤其是臨床上一線抗抑郁藥物治療起效慢、有效率低，因此對(duì)于抑郁癥患者的治療已成為精神科所面臨的巨大挑戰(zhàn)。

阿米替林是臨床上最常用的三環(huán)類抗抑郁藥物，其作用機(jī)制是阻斷5-羥色胺和去甲腎上腺素的再攝取，通過(guò)提高突觸間隙的遞質(zhì)濃度增強(qiáng)突觸傳遞功能發(fā)揮抗抑郁作用[17]?，F(xiàn)有的研究顯示阿米替林能夠促進(jìn)成年哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化、成熟和存活從而增強(qiáng)神經(jīng)再生[19-21]，但有關(guān)其促神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制研究較少。有文獻(xiàn)報(bào)道阿米替林可能通過(guò)促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)及其同源受體(tyrosine kinase receptor B, TrkB)的酪氨酸磷酸化增加，從而促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)再生[19]；此外，阿米替林還可能通過(guò)降低海馬中酸性鞘磷脂酶活性和神經(jīng)酰胺的濃度促進(jìn)神經(jīng)再生[20, 21]；但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在本實(shí)驗(yàn)中我們使用阿米替林作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察它是否通過(guò)改善神經(jīng)再生而逆轉(zhuǎn)大鼠的抑郁樣行為。

在本實(shí)驗(yàn)中觀察到WKY抑郁大鼠海馬的神經(jīng)再生受損，應(yīng)用阿米替林改善其神經(jīng)再生后則使大鼠的抑郁樣行為得到改善，再次證實(shí)了海馬神經(jīng)再生在抑郁癥的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。早在2000年，Duman等人就發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者的海馬體積減小，并伴有神經(jīng)細(xì)胞的萎縮和缺失[22]。近期也有研究顯示抑郁癥患者出現(xiàn)認(rèn)知記憶功能降低的部分原因是減少的神經(jīng)再生及縮小的海馬體積[23, 24]。Hill等人的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)滅活神經(jīng)祖細(xì)胞的促凋亡Bax基因促進(jìn)海馬的神經(jīng)再生，可以減輕由慢性皮質(zhì)酮處理引起的小鼠抑郁樣癥狀[3]。此外，NSI-189磷酸鹽是一種能夠刺激海馬神經(jīng)再生的新型神經(jīng)源性化合物。在重度抑郁癥(major depressive disorder, MDD)患者進(jìn)行的雙盲安全性Ib期研究表明，口服NSI-189具有顯著長(zhǎng)效的抗抑郁和改善認(rèn)知的作用[25]，并在近期的II期研究中也證實(shí)了此療效[6]。這與通過(guò)輻射消融海馬的神經(jīng)再生則取消氟西汀的抗抑郁作用相類似[7]。以上研究表明成年海馬神經(jīng)再生及其調(diào)控會(huì)對(duì)抑郁癥發(fā)病和抗抑郁治療產(chǎn)生顯著影響，因此，海馬神經(jīng)再生情況的改變

Tab. 1 Overview of behavioural tests n=10)

OFT: Open field test；AMI: Amitriptyline

**P<0.01vsWistar group;#P<0.05,##P<0.01vsWKY group

已經(jīng)成為抑郁癥發(fā)病的重要病理機(jī)制之一。綜上所述，本研究在WKY抑郁大鼠觀察到海馬的神經(jīng)再生受損，改善其受損的神經(jīng)再生可以部分逆轉(zhuǎn)大鼠的抑郁樣行為，因此為進(jìn)一步證實(shí)抑郁情感障礙的“神經(jīng)再生假說(shuō)”提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為今后治療抑郁提供理論依據(jù)。