HPLC同時測定疏清口服液中甘草素、甘草酸銨含量

文瑾，楊海寧,車宏偉,張宇佳，鄭穩(wěn)生

(1.中國藥學會，北京 100022；2.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，藥物傳輸技術及新型制劑北京市重點實驗室，北京 100050)

疏清口服液是由甘草、蘆根、桑葉、大青葉和石膏組成的復方制劑，具有清熱解毒，宣泄肺胃的功效，主要用于小兒急性上呼吸道感染屬風熱證。疏清口服液由疏清顆粒更改劑型而來，疏清顆粒的生產(chǎn)廠家為吉林華康藥業(yè)股份有限公司，由于疏清顆粒味苦、服用量大，限制了其在兒童中的應用，公司在調(diào)研中發(fā)現(xiàn)口服液更適宜兒童服用，遂在原方基礎上設計制成疏清口服溶液劑，該項目受到“十三五重大新藥創(chuàng)制”項目的支持。在試驗研究前期主要采用大青葉中主要成分靛玉紅作為浸膏的質(zhì)量控制制標[1]，但是該指標不能反應藥品的整體質(zhì)量，因此需要對其他藥材進行檢測。甘草又名蜜甘、甜草、美草等，是我國常用的大宗藥材，常作為佐使藥應用于中藥方劑，有“中草藥之王”的美譽，具有益氣補脾、清熱解毒、止咳祛痰、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效[2-4]，是疏清口服液重要的組成部分。本試驗采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定甘草中有效成分甘草素、甘草酸銨的含量，以至于更好地控制疏清口服液的質(zhì)量，更好地為兒童用藥發(fā)展服務。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日立Chromaster 5430液相(Hitachi)；色譜柱Agilent Zorbax SB- C18(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)；XS105DU型電子天平(梅特勒)；DTC-27型超聲波清洗機(鼎泰生化科技設備制造有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ (北京神泰偉業(yè)儀器設備有限公司)。

1.2 試藥 甘草酸單銨鹽(批號：X4860010，上海安譜實驗科技股份有限公司)；甘草素(E1315081，Aladdin)；乙腈(批號：G2781296，上海安譜實驗科技股份有限公司)；甲醇(批號：175167，F(xiàn)isher)；磷酸(批號：20151008，北京化工廠)；疏清口服液為本實驗室自制樣品(批號：20180314、20180417、20180426、20180512、20180527)，娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB- C18(4.6 mm×150 mm，3.5μm)；以0.1%的磷酸作為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫，梯度洗脫程序:0～14 min A相的比例保持84%，14～19 min，A 相的比例由84%降至50%，19～50 min A相的比例由50%降至0%；流速1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃;波長237 nm;進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品制備 精密稱定甘草素、甘草酸銨適量于量瓶中，加75%甲醇超聲溶解，放置至室溫加甲醇定容至刻度配成甘草素、甘草酸銨(濃度分別為:128.0、821.6 μg·mL-1)的混合對照品儲備液。取1 mL混合對照品儲備液于10 mL量瓶中加75%的甲醇定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。放置于4 ℃冰箱保存，臨用時放置至室溫。

2.1.2 供試品的制備 稱取處方量大青葉、蘆根、甘草、桑葉四味藥材加75%的甲醇室溫浸漬72 h，滲漉，收集滲濾液及藥渣，滲濾液減壓濃縮至一定密度的清膏。另取藥材石膏加水先煎20 min，后加入醇提藥渣煎煮2次，每次45 min，采用紗布濾過，合并濾液，濃縮至一定密度清膏，合并上述兩清膏，4 000 rpm離心45 min，加入矯味劑、防腐劑，定容至刻度，滅菌，即制備完成。精密移取制備完成的疏清疏清口服液1 mL于25 mL量瓶中，加75%甲醇超聲30 min使溶解，放置至室溫后加75%甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm有機膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性對照制備 取除甘草外的其余處方藥材按照“2.1.2”項下供試品溶液制備方法制備成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 各精密吸取供試品溶液、對照品溶液與陰性對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示陰性對照品溶液的色譜在與甘草素、甘草酸對照品保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，說明陰性對照無干擾，具體色譜圖詳見圖1。

A

B

CA.對照組;B.供試品；C.陰性對照圖1 HPLC譜圖

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品儲備液0.2、0.5、1、2、8 mL分別置于10 mL量瓶中，超聲使溶解，放置至室溫加75%甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm有機膜濾過，精密吸取上述各溶液10 μL進樣。以甘草素和甘草酸銨的標準質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)進行回歸分析，結(jié)果顯示甘草素回歸方程為：Y=6×106X-0.168 3(R2=1)，結(jié)果表明在2.56～102.40 μg·mL-1范圍內(nèi)甘草素的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關系。甘草酸銨回歸方程為：Y=1×106X-31 122(R2=0.999 7)，結(jié)果表明在16.43～657.28 μg·mL-1范圍內(nèi)甘草酸銨的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度考察 精密吸取上述混合對照品溶液各10 μL，按照“2.1”項下色譜條件注入高效液相色譜儀，各重復進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果甘草素、甘草酸銨的峰面積RSD值分別為0.20%、0.37%，表明該色譜方法精密度良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的疏清口服液6份(批號：20180512)各0.5 mL，加入約相當于0.5 mL樣品中甘草素和甘草酸銨含有量的對照品溶液，照“2.1.2”項下方法同法制備供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件測定記錄峰面積，分別計算回收率及RSD值，結(jié)果詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取對照品溶液于0、2、4、8、10、24 h 分別注入高效液相色譜儀，記錄甘草素、甘草酸銨的峰面積，結(jié)果顯示24 h內(nèi)兩物質(zhì)峰面積的RSD值分別為1.08%、1.53%，結(jié)果表明采用甲醇提取供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復性試驗 分別精密吸取同一批次(20180512)疏清口服液6份，每份1 mL，采用“2.3”項下供試品的制備方法制備6份供試品溶液，精密吸取供試品試液各10 μL注入高效液相色譜儀，記錄甘草酸銨與甘草素色譜峰面積，記錄含量結(jié)果，供試品中甘草素含量為374.37 μg·mL-1(RSD=1.3%)，甘草酸銨為2.44 mg·mL-1(RSD=2.3%)，結(jié)果表明使用本方法測定甘草酸銨，甘草素含量重復性良好。

2.3.7 5批疏清口服液中甘草素、甘草酸銨含量 按照上述液相方法檢測近期制備的5批疏清口服液中甘草素與甘草酸銨的含量，驗證試驗工藝的穩(wěn)定性。結(jié)果如表2所示。

表2 5批疏清口服液中甘草素、甘草酸銨含量

3 討論

疏清口服液主要用于治療小兒感冒、發(fā)燒、咽痛、咳嗽等癥，其中包含的五味藥材相互作用，共同發(fā)揮療效。其中甘草作為使藥，起到調(diào)和諸藥，扶正祛邪的功效，是方劑的重要組成部分。甘草最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[5]，其除藥用外還可以用于日常保健、化妝品、煙草等領域，陶弘景在《名醫(yī)別錄》中稱甘草為眾藥之王，且經(jīng)方少有不用者[6-7]。甘草中主要包括甘草素、異甘草素和新異甘草苷等黃酮類成分，甘草酸、甘草次酸和甘草甜素等皂苷類成分、生物堿和多糖等成分[8-9]，現(xiàn)代藥理學研究表明[10]甘草具有抗炎、抗病毒、抗氧化、鎮(zhèn)咳、抗癌等多種藥理作用。在試驗中發(fā)現(xiàn)疏清口服液中甘草有效成分甘草素、甘草酸銨含量較高，因此選擇這兩種成分作為檢測指標。

本文考察了甲醇、75%甲醇、75%乙醇3種不同提取溶劑及不同提取溶劑不同體積(25、50、100 mL)對甘草素和甘草酸銨的提取效率，結(jié)果顯示75%的甲醇提取甘草酸銨的效率更高，提取溶劑的體積對結(jié)果無影響。試驗中還考察了超聲時間對提取效果的影響，結(jié)果顯示超聲30 min即可將口服液中甘草素及甘草酸銨提取完全。

試驗考察了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-磷酸-水作為流動相進行梯度洗脫，以甲醇-水作為流動相時分離效果不好，乙腈-水可以很好地分離各個物質(zhì)但是峰形對稱性不好，最終采用乙腈-磷酸-水系統(tǒng)作為流動相，其重復性好，分離效果好，靈敏度高，可以用于甘草素、甘草酸銨的含量測定。在波長選擇方面甘草素的最佳吸收波長為213 nm，甘草酸銨最大吸收波長為250 nm，結(jié)合DAD全波長掃描3D譜圖，選擇237 nm作為最佳檢測波長。

由于疏清口服液采用的是醇提與水提結(jié)合的兩步提取法，提取濃縮過程中工藝些許變化可能都會對口服液的質(zhì)量造成一定的影響，因此每批口服液中甘草素與甘草酸銨的量可能會略有差異。

綜上所述本文建立的采用高效液相色譜法同時測定疏清口服液中甘草素、甘草酸銨的含量測定，方法具有靈敏度高，重復性好，操作簡單等優(yōu)點，可以為疏清口服液的質(zhì)量標準的建立提供參考。