促胰島β細(xì)胞增生的黃酮類化合物的活體篩選

王沖，林春雨，吳志強(qiáng)，李明玉

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2.廈門(mén)大學(xué)藥學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102)

隨著天然藥物相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的天然藥物被人們所發(fā)現(xiàn)，由此帶來(lái)的對(duì)其活性進(jìn)行篩選的需求也隨之增加。傳統(tǒng)意義上的藥物篩選，通常是基于分子靶點(diǎn)和細(xì)胞表型分析進(jìn)行的藥物篩選[1]。但是這種體外篩選的方式并不能直接反應(yīng)藥物在體內(nèi)的作用效果。近年來(lái)，隨著藥物篩選的發(fā)展，越來(lái)越多的以小型動(dòng)物，如：秀麗線蟲(chóng)、果蠅、斑馬魚(yú)、非洲爪蟾為模型進(jìn)行體內(nèi)藥物篩選的方式正快速發(fā)展[2-3]。這種將藥物直接作用于個(gè)體水平的篩選方式，不僅能夠直接反應(yīng)出藥物對(duì)生物體的毒性影響，而且能夠更加全面地反應(yīng)出藥物對(duì)整個(gè)生物體的影響[4-6]。由于斑馬魚(yú)具有眾多適合藥物篩選應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，如：胚胎透明、便于觀察；繁殖率高、成本較低；體型較小、便于操作等。因此，以斑馬魚(yú)為模型進(jìn)行藥物篩選正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[6-7]。

本文利用斑馬魚(yú)的這一特點(diǎn)，以斑馬魚(yú)為模型進(jìn)行黃酮類化合物的藥物篩選。黃酮類化合物是以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物，廣泛分布于各種植物組織中，如：荷葉、蒲公英、金銀花葉、橘皮、竹葉等[8]。在植物體內(nèi)，黃酮類化合物通常與糖類結(jié)合形成苷類化合物。據(jù)報(bào)道，黃酮類具有多種醫(yī)藥學(xué)功能，如降壓、降糖、降血脂、抗氧化等[9-12]，但具體的機(jī)理尚不清楚。

本文主要探究黃酮類藥物的降糖功效與胰腺β細(xì)胞數(shù)量之間的相互關(guān)系。糖尿病以1型和2型為主，1型糖尿病是自體免疫性疾病，由自體免疫系統(tǒng)破壞產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞引起的[13]。2型糖尿病主要由胰島素抵抗及胰島素相對(duì)缺乏引起的[14]。這兩種糖尿病的最終發(fā)病都會(huì)引起胰島β-細(xì)胞數(shù)量減少或者功能損傷，從而降低胰島素的分泌[15]。而尋找促進(jìn)胰島β-細(xì)胞增生的藥物，以期用在糖尿病治療上一直是科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[16]。本文采用β-細(xì)胞特異性表達(dá)mCherry的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(-1.2ins:H2BmCherry)為模型，進(jìn)行黃酮類化合物促β-細(xì)胞增生的活性篩選。并通過(guò)指示β-細(xì)胞復(fù)制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)][17]，以及指示β-細(xì)胞分化的模型TgBAC(neurod:eGFP)[18]進(jìn)行進(jìn)一步分析。整個(gè)篩選操作簡(jiǎn)單，方法便捷高效，可為黃酮類藥物在糖尿病領(lǐng)域的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器、實(shí)驗(yàn)試劑以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1 儀器 電子天平(舜宇恒平儀器)；體式熒光顯微鏡Leica M165FC(萊卡公司)；正置熒光顯微鏡AXIO IMAGER AI (蔡司公司)；共聚焦顯微鏡Zeiss LSM5(蔡司公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 二甲基亞砜(DMSO，生工，批號(hào)：D807BA001)；潑尼松龍(MCE ，批號(hào)：50-24-8)；磷酸緩沖液(10X PBS，BBI 生命科技，批號(hào)：EB12FA0001)； 羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES，Thermo fisher，批號(hào)：15630080)； 多聚甲醛(PFA，生工，批號(hào)：D606BA0003)； 間氨基苯甲酸乙酯(Sigma公司，批號(hào)：MKBX0252V)； 黃酮類藥物(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)； Amplex Red 試劑盒 (Invitrogen A12222)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型斑馬魚(yú)(AB); Tg(-1.2ins:H2BmCherry)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú); TgBAC(neurod:eGFP) 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú); Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物-斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖以及魚(yú)卵的收集培養(yǎng)

2.1.1 斑馬魚(yú)的飼養(yǎng) 斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)是按照標(biāo)準(zhǔn)的飼養(yǎng)方法：每天3次投喂顆粒飼料，早晚各喂養(yǎng)一次豐年蟲(chóng)卵，并給予適宜的光照(光照∶黑暗=14∶10)和溫度(25 ℃)，并利用堿泵和鹽泵調(diào)節(jié)適宜的pH(pH為7左右)和電導(dǎo)率(電導(dǎo)率為500左右)進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2.2 魚(yú)卵的收集及培養(yǎng) 在夜間避光環(huán)境下將一雌一雄的斑馬魚(yú)共同放置在同一配魚(yú)缸里，第二天白天光照的刺激下，收集沉落在配魚(yú)缸缸底的受精卵。將其放置在魚(yú)卵培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，培養(yǎng)箱中的溫度維持在28.5 ℃，光照∶黑暗的時(shí)間比為14∶10。在培養(yǎng)期間，每天都應(yīng)更換新鮮的斑馬魚(yú)水溶液，以維持斑馬魚(yú)生活環(huán)境的清潔。

2.2 斑馬魚(yú)的藥物處理 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(-1.2ins:H2BmCherry)、Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]、TgBAC(neurod:eGFP)產(chǎn)生的胚胎發(fā)育至第5天，轉(zhuǎn)移至24孔板中，將每一孔中加入2 mL的斑馬魚(yú)水溶液、10條魚(yú)和2 μL的藥物(終濃度為10 μmol·L-1),并處理24 h。藥物處理時(shí)，以 DMSO為空白對(duì)照組，以潑尼松龍(Prednisolone，10 μmol·L-1)為陽(yáng)性對(duì)照組。

2.3 斑馬魚(yú)的固定、胰島β細(xì)胞的成像和計(jì)數(shù) 藥物處理過(guò)斑馬魚(yú)胚胎用4% PFA進(jìn)行過(guò)夜固定。固定好的斑馬魚(yú)胚胎，轉(zhuǎn)移至載玻片上，并使右側(cè)朝上，在其上面滴加適量封片劑進(jìn)行封片。封片完畢后，利用斑馬魚(yú)自身的胰島β細(xì)胞所帶有的熒光蛋白進(jìn)行共聚焦顯微成像和細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)。

2.4 斑馬魚(yú)血糖含量的測(cè)定 利用Amplex Red 試劑盒測(cè)定斑馬魚(yú)幼魚(yú)的葡萄糖含量。每10條魚(yú)勻漿于100 μL的緩沖液中，然后利用離心的方法清除勻漿。按照試劑盒的要求，每10 μL的上層清液就等同于一條幼魚(yú)，對(duì)每條魚(yú)的血糖進(jìn)行測(cè)量。室溫下孵育30 min。然后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量其熒光值，設(shè)置的波長(zhǎng)分別為：激發(fā)光：520 nm，發(fā)射光：580～640 nm。藥物處理時(shí)，以 DMSO為空白對(duì)照組，以羅格列酮(RGZ,10 μmol·L-1)為陽(yáng)性對(duì)照組。每一組應(yīng)做3個(gè)重復(fù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)胰島β細(xì)胞的增生作用分析 我們選取了11種不同的黃酮類化合物，包括脫水淫羊藿素、淫羊藿素、香葉木素、柳穿魚(yú)黃素、高黃芩素(野黃芩素)、甘草查爾酮C、芫花素、羥基芫花素、穗花杉雙黃酮、洋艾素和銀杏雙黃酮。利用Tg(-1.2ins:H2BmCherry)斑馬魚(yú)胚胎，對(duì)這些化合物進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的β細(xì)胞為(32.67±1.922)，潑尼松龍作為陽(yáng)性藥物，也能夠增加β細(xì)胞的數(shù)量。而黃酮類化合物中，柳穿魚(yú)黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮與空白對(duì)照DMSO相比，能夠增加紅色胰島β細(xì)胞的數(shù)量，分別為(37.60±1.951)、(37.53±1.786)、(45.00±2.714)、(33.77 ±2.612)和(37.33±2.762)(見(jiàn)圖1～2)。我們選取高于DMSO組的化合物進(jìn)行下一步分析。

A.空白對(duì)照;B.柳穿魚(yú)黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.甘草查爾酮C;H.芫花素;I.羥基芫花素;J.穗花杉雙酮;K.洋艾素;L.銀杏雙黃酮;M.陽(yáng)性對(duì)照；與空白對(duì)照組比較，**P<0.01圖1 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)胰島β細(xì)胞增生作用的篩選

A.空白對(duì)照;B.柳穿魚(yú)黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D2 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)胰島β細(xì)胞增生作用共聚焦拍攝圖

3.2 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)胰島β細(xì)胞的復(fù)制作用分析 由于胰島β細(xì)胞的增生的來(lái)源之一為已有的β細(xì)胞的復(fù)制。我們選取了5個(gè)促進(jìn)β細(xì)胞增生的黃酮類化合物，并利用指示β-細(xì)胞復(fù)制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]進(jìn)行分析。在該模型中，胰島β-細(xì)胞特異性表達(dá)S/G2/M期的特異性蛋白Geminin，并以mAG(monomeric Azami green)-Geminin 融合蛋白的形式展現(xiàn)，經(jīng)過(guò)復(fù)制的細(xì)胞會(huì)表達(dá)綠色熒光[16]。藥物處理24 h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，淫羊藿素和陽(yáng)性藥潑尼松龍能夠促進(jìn)綠色β細(xì)胞的復(fù)制，數(shù)量分別為：(2.750±0.491 0)和(5.636±0.855 7)，高于對(duì)照組的(1.556±0.242 2)(見(jiàn)圖3～4)。

A.空白對(duì)照;B.柳穿魚(yú)黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.陽(yáng)性對(duì)照；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，***P<0.001圖3 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)胰島β細(xì)胞復(fù)制的作用分析

A.空白對(duì)照;B.柳穿魚(yú)黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D4 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)胰島β細(xì)胞復(fù)制的作用共聚焦拍攝圖

這些結(jié)果表明，在這些黃酮類藥物中，柳穿魚(yú)黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮能夠增加β細(xì)胞的數(shù)量。而淫羊藿素促進(jìn)β細(xì)胞的增加部分來(lái)源于β細(xì)胞自身的復(fù)制。

3.3 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)胰島β細(xì)胞的分化作用分析 由于胰島β細(xì)胞增生的另一來(lái)源為胰島前體細(xì)胞分化為成熟β細(xì)胞。我們選取了促進(jìn)5個(gè)β細(xì)胞增生的黃酮類化合物，并利用指示β-細(xì)胞分化的模型TgBAC(neurod:eGFP)進(jìn)行分析。在該模型中，neurod是胰島前體細(xì)胞的標(biāo)記基因之一，來(lái)源于前體細(xì)胞的新β-細(xì)胞將表達(dá)eGFP綠色熒光[18]。柳穿魚(yú)黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮等藥物對(duì)TgBAC(neurod:eGFP)處理24 h后，我們統(tǒng)計(jì)了誘導(dǎo)分化的β細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，柳穿魚(yú)黃素能夠促進(jìn)β細(xì)胞的分化，數(shù)量分別為(5.667±0.881 9)，高于對(duì)照組的(3.000±0.577 4)(圖5～6)。

A.空白對(duì)照;B.柳穿魚(yú)黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.潑尼松龍圖5 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)β細(xì)胞分化作用的分析

A.空白對(duì)照;B.柳穿魚(yú)黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.潑尼松龍圖6 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)β細(xì)胞分化作用的分析共聚焦拍攝圖

3.4 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)血糖水平的統(tǒng)計(jì)分析 由于脫水淫羊藿素、淫羊藿素、柳穿魚(yú)黃素、芫花素、銀杏雙黃酮、潑尼松龍能促進(jìn)β細(xì)胞數(shù)量的增加，因此我們還進(jìn)一步對(duì)藥物處理的斑馬魚(yú)進(jìn)行血糖水平的測(cè)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)柳穿魚(yú)黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素都能夠降低斑馬魚(yú)的血糖，血糖值分別為：(153.5±2.202)、(171.2±12.25)、(171.6±6.978)pmol，明顯低于空白對(duì)照組的(288.1±22.58)pmol。這些結(jié)果說(shuō)明，這幾種黃酮類藥物具有降低血糖的作用(見(jiàn)圖7)。

A.空白對(duì)照;B.柳穿魚(yú)黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.潑尼松龍;H.陽(yáng)性對(duì)照；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01圖7 黃酮類化合物對(duì)斑馬魚(yú)血糖水平的影響分析

4 分析與討論

本文以斑馬魚(yú)為模型進(jìn)行黃酮類化合物的藥物篩選，以期尋找到能夠促進(jìn)胰島β細(xì)胞增生的藥物。這些研究結(jié)果為將來(lái)開(kāi)發(fā)黃酮類化合物用于糖尿病的治療提供了參考依據(jù)。在以β細(xì)胞數(shù)量為指標(biāo)的篩選過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)柳穿魚(yú)黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮共5種黃酮類化合物能夠促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增生。為進(jìn)一步分析這些增生的胰島β細(xì)胞是通過(guò)復(fù)制還是分化而來(lái)，我們進(jìn)行了進(jìn)一步的探究。我們分別利用指示β-細(xì)胞復(fù)制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]和指示β-細(xì)胞分化的模型TgBAC(neurod:EGFP)，對(duì)促進(jìn)β細(xì)胞增生的化合物進(jìn)行藥物處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素能夠誘導(dǎo)β-細(xì)胞的復(fù)制，但并不能誘導(dǎo)前體細(xì)胞的分化，說(shuō)明了淫羊藿素促進(jìn)β-細(xì)胞的增加部分來(lái)源于自身的細(xì)胞復(fù)制。當(dāng)然，它促進(jìn)增生的β-細(xì)胞的數(shù)量大于復(fù)制增加的細(xì)胞數(shù)量，說(shuō)明還有一些其他的機(jī)制參與β-細(xì)胞數(shù)量的增加。而柳穿魚(yú)黃素促進(jìn)通過(guò)誘導(dǎo)分化增加的β-細(xì)胞的數(shù)量與增生的數(shù)量大致相同，說(shuō)明其促進(jìn)β-細(xì)胞的增生主要?dú)w功于誘導(dǎo)前體細(xì)胞的分化。

由于胰島β細(xì)胞的增加可能會(huì)引起胰島素分泌的增加，從而可能起到降低血糖的作用。我們?cè)诜治龌衔飳?duì)血糖水平影響的分析中發(fā)現(xiàn)，這些有3個(gè)促進(jìn)β-細(xì)胞增生的黃酮類化合物在不同程度上都能起到降低血糖的作用。但是由于斑馬魚(yú)血糖水平的調(diào)節(jié)受到多種信號(hào)通路的影響，這些能夠促進(jìn)β細(xì)胞數(shù)量增加的藥物是如何參與血糖水平的調(diào)控，還需進(jìn)一步的研究。