薇甘菊頸盲蝽細(xì)胞色素P450 PmCYP4基因克隆及表達(dá)分析

張傳光， 澤桑梓， 朱家穎， 季 梅， 劉 凌， 張乃明

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201； 2云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明650204； 3云南省林業(yè)有害生物防治檢疫局，云南 昆明 650051； 4西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224

薇甘菊MikaniamicranthaH. B. K.是世界上最具侵略性的雜草之一(范志偉等,2016; Mingetal.,2017)，也是唯一一種全國林業(yè)檢疫有害植物(徐小偉等,2014)。物種在入侵過程中與入侵生境中其他物種相互競(jìng)爭(zhēng)、協(xié)同適應(yīng)，如入侵我國云南的薇甘菊揮發(fā)油內(nèi)普遍存在β-cadinene、allo-aromadendrene、β-caryophyllene及5-(1,1-dimethylethyl)-2,3-1H-Inden-1-one 等多碳化合物(季梅等,2012; 孫盟等,2013)，而生長在原產(chǎn)地秘魯?shù)霓备示諜z測(cè)不到這些物質(zhì)，說明入侵地薇甘菊的次生代謝物種類發(fā)生了改變，且含量也明顯增加(Nietal.,2007)。此外，薇甘菊在入侵的過程中其體內(nèi)的化學(xué)防御素——縮合單寧也顯著高于本地物種(倪廣艷等,2014)。

Yiran & Liu (2017)首次報(bào)道了一個(gè)專食薇甘菊的新種——薇甘菊頸盲蝽PachypeltismicranthusMu et Liu，是控制云南省瑞麗市薇甘菊的一種本土天敵昆蟲。研究發(fā)現(xiàn)，被薇甘菊頸盲蝽取食后，薇甘菊葉片中的防御性酶POD和PAL的活性下降，PPO活性提高(季梅等,2014； 李勝等,2018)，說明在被頸盲蝽取食后薇甘菊很快做出了防御反應(yīng)。植物次生物質(zhì)能對(duì)昆蟲產(chǎn)生不利影響，甚至產(chǎn)生毒殺作用，而昆蟲則通過對(duì)植物次生物質(zhì)忌避取食、解毒代謝等多種機(jī)制，對(duì)寄主植物產(chǎn)生適應(yīng)性(陳澄宇等,2015)。其中，細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450, CYP)作為最古老和最龐大的超基因家族，其介導(dǎo)的多功能氧化酶(microsomal mixed function oxidases，MFO)是昆蟲中涉及抗性的3大主要代謝解毒酶類之一，對(duì)多樣的外源化合物和內(nèi)源化合物的氧化代謝起作用(Hrycay & Bandiera,2009; Omura,1999)，特別是CYP4家族基因在昆蟲對(duì)植物次生物質(zhì)的解毒代謝及與寄主植物相互作用中發(fā)揮了重要作用(吳益東等,1997; Dingetal.,2013; Edietal.,2014; Feyereisen,1999)。

Feyereisenetal. (1989)克隆了第一個(gè)昆蟲CYP基因，此后，昆蟲CYPs逐漸成為研究熱點(diǎn)(艾均文等,2015)。對(duì)于微甘菊頸盲蝽而言，如何應(yīng)對(duì)宿主植物的化學(xué)防御，其體內(nèi)存在何種代謝解毒酶，相關(guān)基因在不同部位的表達(dá)量如何，都未有相關(guān)的報(bào)道。本文旨在克隆薇甘菊頸盲蝽CYP4基因，研究其在不同部位的表達(dá)情況，為深入研究其在薇甘菊頸盲蝽與薇甘菊互作中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx 薇甘菊頸盲蝽采自云南省瑞麗市。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器 Trizol、SMARTTMRACE cDNA amplification kit (Clontech)、DNA Marker DL2000均購自寶生物工程(大連)有限公司，PrimeScripttmRT reagent Kit with gDNA Eraser購自Takara公司。

高速冷凍離心機(jī)(5804R型，德國Eppendorf公司)，PCR儀(Veriti96型，美國Applied Biosystems公司)，熒光定量PCR儀(Rotor Gene-Q型，德國QIAGEN公司)，凝膠成像儀(GBOX iChemi型，英國Syngene公司)，超微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 2000，美國Thermo公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl分別為5、10、10 g·L-1，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7；加入15 g·L-1瓊脂為LB固體培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集方法 將捕捉到的雌、雄活體切分為觸角、殘?bào)w、翅膀、足4個(gè)部分，迅速保存至液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，每部分3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100頭。

1.2.2 總RNA的提取及CYP基因的克隆 參照Trizol試劑說明書，以樣品研磨提取總RNA，提取到的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量，儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱備用。

以提取的總RNA為模板，用SMARTTMRACE cDNA amplification kit (Clontech)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)薇甘菊頸盲蝽cDNA文庫測(cè)序獲得的CYP片段序列，設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE特異性引物(5′-GGCAAAGGTCTGCTGACAAGTA-3′和5′-TGAATGGTACGTAGGCAA

ACGG-3′)，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，參照RACE試劑盒說明書，PCR擴(kuò)增該基因的3′端和5′端序列。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。利用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，TA克隆接入pGEM?-T-easy載體(Promega)，藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆送至昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 序列分析 用ORFfinder (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)將CYP的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；用ProtParam (https:∥web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白進(jìn)行基本進(jìn)化性質(zhì)分析；用SignalP 4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；用ClustalX 1.83進(jìn)行多序列比對(duì)分析進(jìn)化樹(Thompsonetal.,1997)，MEGA 7.0軟件構(gòu)建NJ (neighbor-joining)分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(Kumaretal.,2016)。

1.2.4 熒光定量PCR 用Trizol試劑提取各樣品總RNA，將各樣品總RNA定量至1 μg，用PrimeScripttmRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒對(duì)提取的各樣品總RNA先進(jìn)行基因組DNA的去除，定量后再反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板。根據(jù)實(shí)驗(yàn)前期克隆獲得的CYP cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物(5′-CGTTTTTCTCCGAGCGTTC-3′和5′-TTGAACTTCGA

CGGGTTGG-3′)，對(duì)該基因在薇甘菊頸盲蝽不同性別、不同部位中的表達(dá)量進(jìn)行熒光定量PCR分析。以18S RNA為內(nèi)參基因(5′-TTTCAAATGTCTGCCTTATC-3′和5′-TGTGGTAGCCGTTTCTCA-3′)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，39個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR結(jié)果采用E-??CT法進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)該方法把表達(dá)量最低的樣品表達(dá)量值定義為1(Livak & Schmittgen,2001)。最后，用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、IBM SPSS Statistics進(jìn)行方差分析和S-N-K多重比較、Origin Pro 2016進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 PmCYP4生物信息學(xué)分析

2.1.1PmCYP4編碼氨基酸理化性質(zhì)PmCYP4 cDNA全長1713 bp，ORF為1500 bp，編碼500個(gè)氨基酸，5′端非編碼區(qū)27 bp，3′端非編碼區(qū)183 bp，無信號(hào)肽(圖1)。編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)見表1。

圖1 PmCYP4基因的開放閱讀框和推測(cè)的氨基酸序列Fig.1 ORF and the deduced amino acid sequences of PmCYP4

指標(biāo)Index預(yù)測(cè)結(jié)果 Predicted outcome分子式 Molecular formulaC2611H4061N673O739S23分子質(zhì)量 Molecular weight/(ku)57.44氨基酸數(shù) Number of amino acids500等電點(diǎn) Isoelectric point6.93負(fù)電荷殘基 Asp+Glu63正電荷殘基 Arg+Lys62平均親水系數(shù)Average hydrophilicity-0.279不穩(wěn)定系數(shù) Instability index28.84脂肪系數(shù) Aliphatic index84.02

2.1.2PmCYP4基因序列分析PmCYP4編碼的氨基酸序列中的2個(gè)保守區(qū)域見圖1和圖2(下劃線部分)：(1)CYP4家族成員保守區(qū)EVDTFMFEGHDTT(周夏,2015);(2)FXXGXXXCXG/A區(qū)域，為紅素結(jié)合環(huán)，C是保守的半胱氨酸，X代表任意密碼子，其為血紅素鐵第5個(gè)配體，也是在450 nm處與CO結(jié)合產(chǎn)生吸收峰特征性光譜的原因(邱星輝和冷欣夫,1998; 鄭明奇等,2001)。

不同物種、不同來源的CYP基因均有高度的序列同源性，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PmCYP4與地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata、家蠅Muscadomestica、辣椒實(shí)蠅Bactroceralatifrons、銅綠蠅LuciliacuprinaCYP4的氨基酸同源性分別為41%、42%、43%、45%(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，PmCYP4與溫帶臭蟲CimexlectulariusCPY4基因編碼的蛋白同源性處于同一分支上，進(jìn)化關(guān)系最近(圖3) 。

圖2 PmCYP4與其他昆蟲CYP多序列比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of PmCYP4 and other insects CRY：砂白蟻,PNF27066.1;ZOO：內(nèi)華達(dá)古白蟻,KDR12230.1;NIL：褐飛虱,AIW79997.1;CAM：佛羅里達(dá)弓背蟻，XP_025266601.1;PAC：薇甘菊頸盲蝽。下劃線部分為PmCYP4編碼的氨基酸序列中的2個(gè)保守區(qū)域。黑色和灰色陰影分別表示保守性極高和較高的殘基位點(diǎn)。 CRY： Cryptotermes secundus, PNF27066.1; ZOO： Zootermopsis nevadensis, KDR12230.1; NIL： Nilaparvata lugens, AIW79997.1;CAM： Camponotus floridanu, XP_025266601.1; PAC： Pachypeltis micranthus. The underlined parts were two conserved domains of the amino acid sequences of PmCYP4. Residues identical or similar are highlighted in black and grey respectively.

圖3 PmCYP4基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of PmCYP4CER:地中海實(shí)蠅,XP_004521346.1;BAC:辣椒實(shí)蠅,XP 018799661.1;MUS:家蠅,XP_005186030.1;LUC:銅綠蠅, XP_023297259.1;FOP:阿里山潛蠅繭蜂,XP_011300548.1;NEO:紅頭松葉蜂,XP_015512314.1;ZOO:內(nèi)華達(dá)古白蟻,XP_021934792.1;CRY:砂白蟻,XP_023705844.1;ONT:嗡蜣螂,XP_022906724.1;HAL:茶翅蝽,XP_014284338.1;CIM:溫帶臭蟲,XP_014249034.1。CER: Ceratitis capitata, XP_004521346.1; BAC: Bactrocera latifrons, XP 018799661.1; MUS: Musca domestica, XP_005186030.1; LUC: Lucilia cuprina, XP_023297259.1; FOP: Fopius arisanus, XP_011300548.1; NEO: Neodiprion lecontei, XP_015512314.1; ZOO: Zootermopsis nevadensis, XP_021934792.1; CRY: Cryptotermes secundus, XP_023705844.1; ONT: Onthophagus taurus, XP_022906724.1;HAL: Halyomorpha halys, XP_014284338.1; CIM: Cimex lectularius, XP_014249034.1.

2.2 mCYP4基因熒光定量PCR分析

PmCYP4在薇甘菊頸盲蝽雌、雄蟲中的表達(dá)量都是足中最高，顯著高于翅膀、觸角、殘?bào)w。雌蟲殘?bào)w中表達(dá)量最低，觸角、翅膀、足中的表達(dá)量分別是其1.15、1.88和11.90倍，殘?bào)w、觸角和翅膀中的表達(dá)量無顯著差異；雄蟲觸角表達(dá)量最低，殘?bào)w、翅膀、足中的表達(dá)分別是其1.02、6.07和16.32倍，且翅膀中的表達(dá)量顯著高于殘?bào)w和觸角，而殘?bào)w和觸角中的表達(dá)量無顯著差異；雌蟲翅膀、殘?bào)w及觸角與雄蟲相應(yīng)組織中的表達(dá)量無顯著差異，但雄蟲翅膀中的表達(dá)量顯著高于雌蟲翅膀，是其2.37倍(圖4)。

圖4 PmCYP4基因在薇甘菊頸盲蝽不同部位中的表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of PmCYP4 gene in different parts of P. micranthusFA:雌蟲觸角；FB:雌蟲殘?bào)w；FL:雌蟲足；FW:雌蟲翅膀；MA:雄蟲觸角；MB:雄蟲殘?bào)w； ML:雄蟲足；MW:雄蟲翅膀。不同字母表示在 5%水平上差異顯著。FA: Antenna of female; FB: Residual body of female; FL: Leg of female; FW: Wing of female; MA: Antenna of male; MB: Residual body of male; ML: Leg of male; MW: Wing of male. Different letters mean significant differences at 5% level．

3 討論

CYP基因家族包括36個(gè)基因族(李顯春等,1999; 張宇宏等,2015)，昆蟲中已鑒定的CYP分屬于CYP4、CYP6、CYP9、CYP12、CYP18、CYP28等27個(gè)家族，除CYP4家族外全是昆蟲特異的家族(Feyereisen,1999)。通過序列比對(duì)，此次克隆到的薇甘菊頸盲蝽PmCYP4基因與CYP4家族基因編碼的蛋白同源性最高,且存在2個(gè)保守區(qū)域。Blast結(jié)果表明，薇甘菊頸盲蝽CYP基因與其他昆蟲的CYP4家族的同源性都大于40%，所以PmCYP4應(yīng)屬于CYP4家族。

CYP4基因起源于1000多萬年前，早于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物分化(Bradfieldetal.,1991)，其功能包括促進(jìn)多種激素及甾醇的生物合成和降解，調(diào)節(jié)昆蟲發(fā)育和形態(tài)改變(楊帆和王進(jìn)軍,2008)，代謝植物有毒物質(zhì)、多種殺蟲劑,誘導(dǎo)誘變劑等(Gu & Knipple,2013)。薇甘菊頸盲蝽的CYP4家族基因的主要作用可能是調(diào)節(jié)內(nèi)源性物質(zhì)和代謝食物中的有毒物質(zhì)，PmCYP4應(yīng)主要分布于中腸、脂肪體和馬氏管中，表達(dá)部位及量應(yīng)無性別差別,在殘?bào)w中有幾乎同水平的表達(dá)量，但表達(dá)量很低。因此，PmCYP4基因可能參與了食物源有毒化合物的代謝，但不是其主要功能。CYP4基因也參與了信息素的失活(Lazardetal.,1990; Ma?bèchecoisneetal.,2005)。在繁殖期，薇甘菊頸盲蝽雌蟲通過氣味分子來引誘雄蟲交尾(王大偉等,2014; 澤桑梓等,2017)，而PmCYP4基因在雌、雄蟲觸角中的表達(dá)量很低且無差異，所以PmCYP4基因沒有參與性信息素的失活，但可能參與了環(huán)境信息素的失活。

本研究發(fā)現(xiàn)，PmCYP4在雌、雄蟲的足中表達(dá)量顯著大于其他部位，雄蟲翅膀中的表達(dá)量顯著大于雌蟲，GO數(shù)據(jù)庫對(duì)此基因的功能注釋之一是作為配對(duì)供體，結(jié)合或減少氧分子來增加氧化還原酶活性(GO:0016705)。前期對(duì)薇甘菊頸盲蝽的生物特性研究中發(fā)現(xiàn)，該蟲的爬行能力較強(qiáng)，飛翔能力較弱，且雄蟲飛翔能力遠(yuǎn)強(qiáng)于雌蟲，據(jù)此推測(cè)，PmCYP4的主要功能可能是編碼與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的酶。