高通量測(cè)序技術(shù)分析光葉珙桐根際土壤微生物多樣性

程立君，王 磊，吳銀梅 ，高興國(guó)，師 睿 ，胡志芳

（1.昭通學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昭通 657000；2.昭通高原特色農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)平臺(tái)，云南 昭通 657000；3.昭通蘋果產(chǎn)業(yè)研究所，云南 昭通 657000）

【研究意義】珙桐（Davidia involucrateBaill）又稱為鴿子樹，屬珙桐科（Nyssaceae）珙桐屬（Davidia）雙子葉植物，是我國(guó)特有的第三紀(jì)古熱帶植物的孑遺樹種，被列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物［1-2］，具有很高的觀賞價(jià)值和科研價(jià)值。但珙桐自然分布不連續(xù)，資源量很少，外界自然環(huán)境條件是影響其分布和繁育的主要因素，其中干旱是主要生態(tài)限制因子之一。因此可以嘗試篩選珙桐根際微生物優(yōu)勢(shì)菌群，利用土壤微生物的活動(dòng)能力，提升珙桐的逆境條件下的生存能力?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)80年代以來，前人對(duì)珙桐的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、人工繁殖技術(shù)及引種栽培、生理生化以及分子生物學(xué)和遺傳多樣性等多個(gè)方面開展了大量的研究，并取得了一些進(jìn)展，但在珙桐引種繁殖、植物化學(xué)成分等研究方向上還需更深層次的發(fā)展，尤其是在異地引種和開花結(jié)實(shí)方面研究不夠成熟，限制了珙桐作為園藝觀賞植物進(jìn)行廣泛栽培。有研究者對(duì)其繁育和引種開展了許多工作，但效果均不理想［3-5］，原因是珙桐對(duì)土壤干旱脅迫極為敏感［6］，耐旱能力較差［7］。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的成分［8］，其參與物質(zhì)循環(huán)代謝過程，在改善土壤理化性質(zhì)、調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分的貯存和釋放等方面起關(guān)鍵作用，并影響植物生長(zhǎng)［9-10］，根際微生物多樣性能緩解干旱和鹽堿脅迫對(duì)植物生理的影響［11］，尤其是菌根菌能與植物根微系形成菌根共生體，菌根的物理生理特性能提高植物在逆境條件下的生存能力，如氣候干旱、土壤貧瘠等障礙因素［12］，如胡楊根際微生物對(duì)胡楊的逆境抗性有重要作用，王珊珊［13］從胡楊根際土壤中篩選得到10株高效促生抗逆菌；有研究表明，叢枝菌根真菌（AMF）可提高青楊雌雄株抗旱性［14］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究嘗試采用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)永善三江口、彝良縣小草壩和鎮(zhèn)雄塘房3個(gè)地區(qū)的光葉珙桐根際土壤中細(xì)菌和真菌的多樣性進(jìn)行研究，分析光葉珙桐自然條件下根際土壤微生物的共同特征與差異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)比不同地區(qū)光葉珙桐根際土壤微生物多樣性和主要菌群的差異，為今后篩選提高其抗旱能力的根際微生物和探索引種繁育新途徑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年8月，從昭通地區(qū)3個(gè)光葉珙桐自然分布區(qū)（永善三江口、彝良小草壩、鎮(zhèn)雄塘房）進(jìn)行土樣采集（避免雨季），具體操作是在每個(gè)地點(diǎn)用土壤取樣器采集光葉珙桐根基土壤各5份，深度為0～40 cm，將在多個(gè)地點(diǎn)采集的土壤分別進(jìn)行充分混合，并除去較大的石塊、雜草、根系等雜物后，對(duì)獲得的3個(gè)土樣分別采用四分法留取土樣，于-80℃冷凍保存，用于土壤微生物多樣性分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤微生物總DNA提取 準(zhǔn)確稱取0.30 g土壤樣品，采用OMEGA試劑盒法提取土壤樣品中微生物總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，用Mini Dorp測(cè)定DNA純度和濃度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 樣品總DNA提取后，采用Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)的通用引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3+V4區(qū)域和真菌ITS1區(qū)域分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性35 s、57℃退火30 s、72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化，形成測(cè)序文庫(kù)，由北京百邁客生物科技有限公司通過Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。PCR擴(kuò)增通用引物包括V3+V4區(qū)域（428 bp）引物（上游引物5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'，下游引 物 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'） 和真菌ITS1區(qū)域（187～298 bp）引物（上游引物5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'，下游引物5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

1.3.1 生物信息學(xué)分析 原始數(shù)據(jù)存在一定的干擾數(shù)據(jù)，先將測(cè)得的原始序列截去Barcode序列和引物序列，使用FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags）；使用Trimmomatic v0.33軟件，對(duì)拼接得到的Raw Tags進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）；使用UCHIME v4.2軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。使用QIIME軟件中的UCLUST對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得OTU，統(tǒng)計(jì)各個(gè)土壤樣品每個(gè)OTU中的豐度信息。采用隨機(jī)抽樣的方法抽取數(shù)據(jù)，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建曲線，即稀釋性曲線，利用Mothur軟件和R語(yǔ)言工具繪制稀釋曲線圖。

1.3.2 物種組成分析 基于Silva（細(xì)菌）和UNITE（真菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，確定序列的分類信息，獲得門、綱、目、科和屬各水平下的分類單元。利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語(yǔ)言工具繪制成樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。

1.3.3 多樣性分析 Alpha多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性，有Chao1、Ace、Shannon、Simpson等多種衡量指標(biāo)。基于OTU的結(jié)果，利用Mothur軟件計(jì)算豐富度指數(shù)（Chao、Ace）和Alpha多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）來進(jìn)行生物多樣性分析。使用QIIME軟件進(jìn)行Beta多樣性分析，比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度?；诟鳂悠沸蛄虚g的進(jìn)化信息的差異來計(jì)算樣品間的差異，利用距離算法（binary、bray、weighted、unweighted）得到樣品間的距離矩陣，通過R語(yǔ)言工具繪制樣品熱圖（Heatmap）和采用非加權(quán)配對(duì)平均法（UPGMA）對(duì)樣品進(jìn)行層次聚類繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 光葉珙桐根際土壤細(xì)菌和真菌OTU水平分析

經(jīng)數(shù)據(jù)前處理，3個(gè)樣品（永善三江口、彝良小草壩和鎮(zhèn)雄塘房）總DNA的16S rDNA V3+V4區(qū)經(jīng)測(cè)序分析得到67 712～68 829條有效序列數(shù)據(jù)（表1），序列長(zhǎng)度集中在390～450 bp之間，平均長(zhǎng)度分別為419、415、421 bp，從序列長(zhǎng)度來看，與16S rDNAV3+V4區(qū)序列長(zhǎng)度大致吻合，進(jìn)行聚類后分為2 293個(gè)OTUs（序列相似性＞97%）。3個(gè)樣品總DNA的ITS區(qū)經(jīng)測(cè)序分析得到69 510～69 717條有效序列數(shù)據(jù)（表1），序列長(zhǎng)度集中在160～340 bp之間，平均長(zhǎng)度分別為230、218、244 bp，進(jìn)行聚類后分為880個(gè)OTUs。從3個(gè)土樣中細(xì)菌和真菌的rarefaction曲線（圖1）可以看出，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，它們所能代表構(gòu)建的OTU數(shù)目增加，曲線的斜率逐漸上升，后趨于平緩，同時(shí)樣品所得到的序列的覆蓋度均高于90%，說明本研究測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，可反映樣品中微生物群落的種類和結(jié)構(gòu)。

2.2 光葉珙桐根際土壤微生物物種組成分析

本研究檢測(cè)到的細(xì)菌和真菌種類繁多，其中很多物種的含量非常少，為使視圖效果最佳，柱狀圖只顯示豐度水平排名前10的真菌和細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌，并將其他物種合并為Others在圖中顯示，Unknown代表未得到分類學(xué)注釋的物種，以相對(duì)豐度為縱坐標(biāo)繪制柱形圖。圖2A和圖2B分別展示了樣品中相對(duì)豐度排名前10個(gè)綱的細(xì)菌和真菌，表明光葉珙桐根際土壤中細(xì)菌主要分布于以下10個(gè)綱：α-變形菌綱Alphaproteobacteria、Subgroup_6、δ-變 形 菌 綱 Deltaproteobacteria、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、酸桿菌綱Acidobacteria、β-變形菌綱 Betaproteobacteria、索利氏菌綱Solibacteres、Subgroup_2、放線菌綱Actinobacteria、芽單胞菌綱Gemmatimonadetes（圖2A），其中α-變形菌綱Alphaproteobacteria最豐富，在3個(gè)土樣中相對(duì)豐度分別為19.37%、18.48%、17.02%。永善三江口、鎮(zhèn)雄塘房土樣中主要細(xì)菌種類的相對(duì)豐度比較相近，與彝良小草壩土樣差異較大，尤其是在Subgroup_2和算桿菌綱Acidobacteria的相對(duì)豐度分別高達(dá)14.93%和10.05%，而在永善三江口土樣（0.36%、2.50%）和鎮(zhèn)雄塘房土樣（0.04%、0.14%）中含量較低；真菌主要分布于以下10個(gè)綱：糞殼菌綱Sordariomycetes、傘菌綱Agaricomycetes、古菌綱 Archaeorhizomycetes、Mortierellomycotina_cls_Incertae_sedis、盤菌綱Pezizomycetes、散囊菌綱Eurotiomycetes、座囊菌綱Dothideomycetes、球囊菌綱Glomeromycetes、錘舌菌綱Leotiomycetes、銀耳綱Tremellomycetes（圖2B），不同地區(qū)的土樣中真菌菌群分布有明顯差異，在永善三江口土樣中相對(duì)豐度最高的3個(gè)種類是盤菌綱Pezizomycetes（17.01%）、糞殼菌綱Sordariomycetes（15.04%）、Mortierellomycotina_cls_Incertae_sedis（7.64%），在彝良小草壩土樣中相對(duì)豐度最高的3個(gè)種類是古菌綱Archaeorhizomycetes（29.79%）、傘菌綱Agaricomycetes（20.90%）、糞 殼 菌 綱 Sordariomycetes（4.87%）， 在 鎮(zhèn)雄塘房土樣中相對(duì)豐度最高的3個(gè)種類是糞殼 菌 綱 Sordariomycetes（20.77%）、 傘 菌 綱Agaricomycetes（10.53%）、Mortierellomycotina_cls_Incertae_sedis（8.35%）， 其 中 盤 菌 綱Pezizomycetes在永善三江口土樣中相對(duì)豐度為17.01%，而在彝良小草壩和鎮(zhèn)雄塘房土樣中含量很低或未檢測(cè)出，傘菌綱Archaeorhizomycetes在彝良小草壩土樣中相對(duì)豐度為29.79%，而在永善三江口、鎮(zhèn)雄塘房土樣中含量很低甚至未檢測(cè)出。相對(duì)豐度大于1%的種類在3個(gè)樣品中都有分布的只有傘菌綱Agaricomycetes、Mortierellomycotina_cls_Incertae_sedis和糞殼菌綱Sordariomycetes，其中傘菌綱Sordariomycetes在3個(gè)樣品中都具有較高的相對(duì)豐度，分別為15.04%、4.87%、20.77%。

表1 光葉珙桐根際土壤樣品測(cè)序的tags信息及OTU統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Tags information and OTU statistical analysis of rhizosphere soil sample sequencing of D. involucrate

圖1 光葉珙桐根際土壤樣品細(xì)菌和真菌測(cè)序的稀釋曲線Fig. 1 Dilution curves of bacterial and fungi sequencing of rhizosphere soil samples of D. involucrate

圖2 光葉珙桐根際土壤樣品細(xì)菌群落和真菌群落分布Fig. 2 Distribution of bacterial community and fungi community in rhizosphere soil samples of D. involucrate

2.3 光葉珙桐根際土壤微生物多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性分析 從Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果（表2）可以看出，3個(gè)樣品都具有較高的細(xì)菌和真菌群落多樣性。3個(gè)土樣中細(xì)菌群落多樣性Chao1指數(shù)平均值和Shannon指數(shù)平均值表現(xiàn)為永善三江口＞鎮(zhèn)雄塘房＞彝良小草壩，可見永善三江口光葉珙桐根際土壤細(xì)菌多樣性最豐富；真菌群落多樣性Chao1指數(shù)值表現(xiàn)為鎮(zhèn)雄塘房＞彝良小草壩＞永善三江口，Shannon指數(shù)值表現(xiàn)為鎮(zhèn)雄塘房＞永善三江口＞彝良小草壩?？梢?，光葉珙桐根際土壤真菌豐富度方面鎮(zhèn)雄塘房＞彝良小草壩＞永善三江口，多樣性方面鎮(zhèn)雄塘房＞永善三江口＞彝良小草壩。

表2 光葉珙桐根際土壤樣品根際土壤群落多樣性指數(shù)Table 2 Community diversity index of rhizosphere soil samples of D. involucrate

2.3.2 Beta多樣性分析 圖3為基于距離算法（Unweighted）得到3個(gè)土樣間的距離矩陣，通過R語(yǔ)言工具繪制樣品熱圖Heatmap，根據(jù)顏色變化可以看出樣品間的差異性，結(jié)果表明永善三江口和鎮(zhèn)雄塘房地區(qū)光葉珙桐根際土壤中細(xì)菌菌群（圖3A）和真菌菌群（圖3B）的相似性均較高。

圖3 光葉珙桐根際土壤樣品加權(quán)UniFrac的heatmap圖Fig. 3 Heatmap diagram of Weighted Unirac of rhizosphere soil samples of D.involucrate

根據(jù)每個(gè)樣品OTU的組成情況，基于Beta多樣性分析得到的距離矩陣，通過R語(yǔ)言工具采用非加權(quán)配對(duì)平均法（UPGMA）對(duì)樣品進(jìn)行層次聚類，可以判斷樣品間物種組成的相似性，圖4是3個(gè)土樣中細(xì)菌和真菌OTU豐度的聚類分析結(jié)果，樣品越靠近，枝長(zhǎng)越短，說明兩個(gè)樣品的物種組成越相似，結(jié)果顯示永善三江口和鎮(zhèn)雄塘房地區(qū)OTU水平相似，與彝良小草壩地區(qū)根際細(xì)菌和真菌菌群的相似性較低。

圖4 基于OTU的光葉珙桐根際土壤樣品樣本樹狀聚類結(jié)果Fig. 4 Clustering diagram of rhizosphere soil samples of D. involucrate based on the OUT

3 討論

珙桐根際土壤微生物多樣性研究報(bào)道較少，楊敬天等［15］對(duì)珙桐土壤微生物數(shù)量及其與土壤因子的關(guān)系做過報(bào)道，但未能反映微生物種類信息、豐度和群落結(jié)構(gòu)等情況。本研究采用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)相較于傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法，該技術(shù)覆蓋了整個(gè)土壤微生物群落的信息，能準(zhǔn)確反映微生物群落的種類、豐度和分布。秦越等［16］研究認(rèn)為，連作會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯根際土壤從“細(xì)菌型”向“真菌型”土壤轉(zhuǎn)化。通過對(duì)永善三江口、彝良小草壩和鎮(zhèn)雄塘房3個(gè)地區(qū)光葉珙桐根際土壤微生物多樣性分析結(jié)果表明，永善三江口的光葉珙桐根際土壤細(xì)菌多樣性最豐富，鎮(zhèn)雄塘房的光葉珙桐根際土壤真菌多樣性最豐富。羅柏青等［17］對(duì)滇東北珙桐群落調(diào)查的結(jié)果顯示，永善三江口和彝良小草壩珙桐徑級(jí)分布呈現(xiàn)出穩(wěn)定增長(zhǎng)的金字塔型，種群處于穩(wěn)定階段。夏嘉禹等［18］對(duì)鎮(zhèn)雄縣珙桐群落結(jié)構(gòu)調(diào)查結(jié)果顯示呈現(xiàn)倒金字塔形更新較差，處于衰退階段。該珙桐群落結(jié)構(gòu)的調(diào)查結(jié)果與本研究3個(gè)地區(qū)光葉珙桐根際土壤微生物多樣性結(jié)果相吻合，珙桐種群穩(wěn)定的地區(qū)（永善三江口和彝良小草壩）根際土壤細(xì)菌多樣性較豐富，種群處于衰退階段的地區(qū)（鎮(zhèn)雄）光葉珙桐根際土壤真菌多樣性較豐富。光葉珙桐根際土壤細(xì)菌和真菌多樣性的這種變化與光葉珙桐自然分布區(qū)種群結(jié)構(gòu)變化是否也存在聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

永善三江口、彝良縣小草壩和鎮(zhèn)雄塘房3個(gè)地區(qū)光葉珙桐根際土壤中細(xì)菌和真菌物種組成豐富，但不同地區(qū)光葉珙桐根際土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)有一定差異。在綱分類水平上，細(xì)菌中α-變形菌綱Alphaproteobacteria是最優(yōu)勢(shì)綱，永善三江口、彝良縣小草壩和鎮(zhèn)雄塘房3個(gè)地區(qū)的相對(duì)豐度分別為19.37%、18.48%、17.02%，真菌中只有糞殼菌綱Sordariomycetes在3個(gè)樣品中都具有較高的相對(duì)豐度，分別為15.04%、4.87%、20.77%，其他豐度較高的種類都存在明顯差異。通過微生物種群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，永善三江口與鎮(zhèn)雄塘房的光葉珙桐根際土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的相似性較高，其中永善三江口光葉珙桐根際土壤細(xì)菌多樣性最豐富，鎮(zhèn)雄塘房光葉珙桐根際土壤真菌多樣性最豐富。