野生油茶根圍土壤的AM真菌多樣性調(diào)查

摘 要：為探明野生油茶根圍土壤AM真菌的種類組成與多樣性。對(duì)野生油茶根圍土壤AM真菌進(jìn)行分離與形態(tài)學(xué)鑒定，同時(shí)提取土壤DNA，進(jìn)行高通量測(cè)序，通過形態(tài)學(xué)鑒定出3屬6種AM真菌，分別為臺(tái)灣硬囊霉、懸鉤子硬囊霉、黃孢球囊霉、長(zhǎng)孢球囊霉、蜜色無梗囊霉和柯氏無梗囊霉;通過高通量測(cè)序鑒定出球囊霉屬、原囊霉屬、近明囊霉屬等6屬42種AM真菌，其中有36個(gè)VT種;VTX00166和球囊霉屬分別為野生油茶根圍土壤AM真菌的優(yōu)勢(shì)種和優(yōu)勢(shì)屬;與形態(tài)學(xué)鑒定相比，高通量測(cè)序能檢測(cè)出更多的AM真菌種類。

關(guān)鍵詞：油茶;AM真菌;高通量測(cè)序;多樣性

中圖分類號(hào)：Q939.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

油茶（ Camellia oleifera） 為山茶科山茶屬的灌木或小喬木， 是我國特有的木本油料樹種[1]，主要分布在江西、湖南、廣西、廣東、貴州、云南、四川等省份[2]。從油茶籽中提取的油茶籽油富含不飽和脂肪酸，與橄欖油相似，被稱為“東方橄欖油” ，長(zhǎng)期食用，具有降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病的作用[3-4]。AM真菌作為一類分布極為廣泛的土壤微生物，能與陸地生態(tài)系統(tǒng)中80%以上的高等植物形成菌根結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物群落的構(gòu)建，調(diào)控營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)，維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性[5]。野生油茶能與叢枝菌根（Arbuscular Mycorrhiza，AM）真菌共生形成菌根結(jié)構(gòu)，但野生油茶根圍土壤AM真菌的種類組成與多樣性相關(guān)研究報(bào)道鮮見。目前，植物共生AM真菌多樣性研究主要通過AM真菌孢子的形態(tài)學(xué)鑒定，但由于受產(chǎn)孢時(shí)間及鑒定者辨識(shí)能力的影響，造成鑒定種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)際共生種類[6]。高通量測(cè)序具有分辨率高，測(cè)序耗時(shí)短，測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)用于自然環(huán)境中AM真菌多樣性研究[7-9]。本文通過土壤AM真菌高通量測(cè)序技術(shù)與孢子形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合，摸清野生油茶根圍土壤AM真菌的種類組成與多樣性特征，探究野生油茶在自然環(huán)境中的共生狀況。

1"材料與方法

1.1"樣品的采集及預(yù)處理

在貴州省貴陽市花溪區(qū)野生油茶林下設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)（樣點(diǎn)a、b、c），每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)選取15株長(zhǎng)勢(shì)相似的野生油茶，采用抖落法[10]收集其根圍土壤，然后過2 mm土壤篩子，充分混勻。將樣品均分，1份裝入10 mL的無菌離心管中于冰盒保存，進(jìn)行高通量測(cè)序，1份用于AM真功形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2"形態(tài)學(xué)鑒定

稱取20 g土樣，采用濕篩傾析-蔗糖離心法[11]分離AM真菌孢子，將分離得到的孢子于體式顯微鏡下觀察，根據(jù)孢子的大小、形狀、顏色，連孢菌絲等進(jìn)行初步分類統(tǒng)計(jì)，挑取孢子于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子果及孢子的大小、形狀、顏色、表面紋飾，Melzer′s試劑反應(yīng)等特征并進(jìn)行拍照。根據(jù)AM真菌分類專業(yè)網(wǎng)站（http：//www.amf￣phylogeny.com/）和相關(guān)INVAM網(wǎng)站（http：//invam.wvu.edu/home）、波蘭農(nóng)業(yè)大學(xué)（http：//www.zor.zut.edu.pl/）、Mycobank Database（http：//mycobank.org/）的種類描述，參閱本實(shí)驗(yàn)室的AM真菌資源進(jìn)行種屬鑒定。

1.3"總DNA提取、18S rDNA序列擴(kuò)增及高通量測(cè)序

根據(jù)Fast DNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedical，USA）的使用說明進(jìn)行總DNA的提取。DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000 進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量。用兩對(duì)特異性引物AML1/AML2（5′-ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA-3′;5′-GAACCCAAACACTTTGG-TTTCC-3′）和AMV4-5NF/AMDGR（5′-AAGCTCGTAGTTGAATT-TCG-3′;5′-CCCAACTAT-CCCTATTAATCAT-3′）進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增[12]。第一次擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min，32個(gè)循環(huán)（95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s， 72 ℃ 延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min;擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu 聚合酶;0.2 μL BSA，10 ng DNA 模板，補(bǔ)ddH2O至20 μL。第二次PCR反應(yīng)以第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min，30 個(gè)循環(huán)（95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s， 72 ℃ 延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min （PCR 儀：ABI GeneAmp 9700 型）;擴(kuò)增體系與第一次相同。PCR產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4"高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列經(jīng)Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)控，去除低質(zhì)量的序列，F(xiàn)LASH 軟件進(jìn)行拼接，得到優(yōu)化后的序列。再使用Usearch軟件（vsesion 7.0 http：//drive5.com/usearch/），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。從每個(gè)OTU中選擇代表序列與MaarjAM數(shù)據(jù)庫（https：//www.maarjam.botany.ut.ee/）進(jìn)行比對(duì)，將序列相似度≥97%、查詢序列的對(duì)齊長(zhǎng)度≥95%、e值lt;1e-50視為虛擬分子種（virtual taxa;VTs），與MaarjAM數(shù)據(jù)庫不匹配的序列進(jìn)一步基于INSDC數(shù)據(jù)庫，在序列相似度90%和查詢序列的對(duì)齊長(zhǎng)度90%的基礎(chǔ)上選出疑似球囊菌亞門的序列[13]。

1.5"數(shù)據(jù)分析

使用I-Sanger生物信息分析云平臺(tái)（https：//www.i￣sanger.com/）繪制稀釋曲線。使用RStudio與R語言（3.6.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，vegan包計(jì)算α多樣性指數(shù)，pheatmap包繪制熱圖，statnet包和circlize包繪制弦狀圖。使用MEGA7軟件進(jìn)行序列比對(duì)和構(gòu)建Neighbor￣Joinning系統(tǒng)發(fā)育樹。

2"結(jié)果與分析

2.1"測(cè)序質(zhì)量

通過高通量測(cè)序，從樣點(diǎn)a、樣點(diǎn)b、樣點(diǎn)c分別獲得24 790，24 828，20 866條有效序列;OTUs數(shù)分別為29，43，47個(gè)，共67個(gè)。由圖1可知，3個(gè)樣點(diǎn)的稀釋曲線均已趨于平坦，說明測(cè)序深度可以反映野生油茶根圍AM真菌的基本信息。

2.2"AM真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

將67個(gè)OTUs的代表序列與MaarjAM數(shù)據(jù)庫和INSDC數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)58個(gè)OTUs屬于AM真菌。采用鄰接法（Neighbor￣joining）對(duì)58個(gè)OTUs的代表序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，58個(gè)OTUs分屬于6屬42種，其中包含36個(gè)VT種（圖2）。6個(gè)屬分別為球囊霉屬（Glomus）、原囊霉屬（Archaeospora）、近明囊霉屬（Claroideoglomus）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、類球囊霉屬（Paraglomus）、多孢囊霉屬（Diversispora）;在6個(gè)屬中，球囊霉屬有26個(gè)VT種，原囊霉屬有2個(gè)VT種，近明囊霉屬有4個(gè)VT種，無梗囊霉屬有2個(gè)VT種，類球囊霉屬和多孢囊霉屬分別有1個(gè)VT種。

2.3"AM真菌屬水平的相對(duì)豐度分析

從屬水平上來看（圖3），樣點(diǎn)a共檢測(cè)到球囊霉屬（Glomus）、原囊霉屬（Archaeospora）、近明囊霉屬（Claroideoglomus）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、多孢囊霉屬（Diversispora）這5個(gè)屬，其相對(duì)豐度分別為99.44%、0.16%、0.02%、0.33%、0.05%。樣點(diǎn)b共檢測(cè)到球囊霉屬（Glomus）、原囊霉屬（Archaeospora）、近明囊霉屬（Claroideoglomus）、無梗囊霉屬

（Acaulospora）、類球囊霉屬（Paraglomus）、多孢囊霉屬（Diversispora）這6個(gè)屬，其相對(duì)豐度分別為87.63%、1.99%、6.17%、2.49%、0.71%、1.01%。樣點(diǎn)c共檢測(cè)到球囊霉屬（Glomus）、原囊霉屬（Archaeospora）和近明囊霉屬（Claroideoglomus）3個(gè)屬，其相對(duì)豐度分別為96.54%、1.17%和2.29%。其中球囊霉屬（Glomus）的總相對(duì)豐度為94.54%，遠(yuǎn)高于其他5個(gè)屬，為野生油茶根圍AM的優(yōu)勢(shì)屬。

2.4"AM真菌的種豐度分析

將所有種的相對(duì)豐度經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后，繪制種水平的豐度熱圖（圖4）。圖中越偏紅表示其豐度越高，越偏藍(lán)表示其豐度越低。樣點(diǎn)a豐度較高的種有VTX00166、VTX00126、VTX00080、VTX00219;樣點(diǎn)b豐度較高的種有VTX00166、VTX00093、VTX00096、VTX00256;樣點(diǎn)c豐度較高的種有VTX00093、VTX00126、VTX00080、VTX00166。VTX00166在3個(gè)樣點(diǎn)都被檢測(cè)到，且豐度最高，為野生油茶根圍AM真菌的優(yōu)勢(shì)種。

2.5"野生油茶根圍AM真菌的α多樣性指數(shù)

利用R語言中vegan包對(duì)58個(gè)AM真菌的OTUs進(jìn)行分析，得到3個(gè)樣點(diǎn)的AM真菌多樣性指數(shù)（表1）。野生油茶根圍AM真菌的Shannon指數(shù)在2.78～3.09，Simpson指數(shù)在0.86～0.93，Chao1指數(shù)在27.33～44.00，Ace指數(shù)在28.93～44.00。

2.6"野生油茶根圍AM真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

通過形態(tài)學(xué)鑒定出3屬6種AM真菌（圖5）。分別為硬囊霉屬2種：臺(tái)灣硬囊霉（Sclercystis Taiwanensis）和懸鉤子硬囊霉（Sclercystis rubiforme）;球囊霉屬2種：黃孢球囊霉（Glomus flavisporum）和長(zhǎng)孢球囊霉（Glomus dolichosporum）;無梗囊霉屬2種：蜜色無梗囊霉（Acaulospora mellea）和柯氏無梗囊霉（Acaulospora koskei）。

3"討論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)野生油茶根圍土壤AM真菌多樣性進(jìn)行調(diào)查，分析了野生油茶根圍土壤AM真菌在屬和種分類水平上的優(yōu)勢(shì)類群，共檢測(cè)出球囊霉屬、原囊霉屬、近明囊霉屬等6屬42種，其中球囊霉屬為優(yōu)勢(shì)屬，優(yōu)勢(shì)種VTX00166亦屬于球囊霉屬，與WU等[14]在柑橘根圍土壤發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)屬結(jié)果一致。但覃曉娟等[15]在廣西紅壤區(qū)甘蔗根圍土壤中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)屬為根生囊霉屬，說明了不同宿主植物根圍土壤的AM真菌存在不同的優(yōu)勢(shì)類群。

本研究通過形態(tài)學(xué)鑒定出6種AM真菌，分別為臺(tái)灣硬囊霉、懸鉤子硬囊霉、黃孢球囊霉、長(zhǎng)孢球囊霉、蜜色無梗囊霉、柯氏無梗囊霉。其中部分AM真菌在其他植物根圍也有發(fā)現(xiàn)，分布廣泛;如王幼珊等[16]在小葉青岡根圍發(fā)現(xiàn)了臺(tái)灣硬囊霉，羅協(xié)等[17]在鐵仔根圍發(fā)現(xiàn)了懸鉤子硬囊霉和黃孢球囊霉。依靠形態(tài)學(xué)鑒定往往丟失了不產(chǎn)孢的種類，從而低估了AM真菌的物種多樣性[18];因此，與高通量測(cè)序相比，形態(tài)學(xué)鑒定可識(shí)別的AM真菌物種數(shù)相對(duì)較少;高通量測(cè)序更能反映野生油茶根圍AM真菌多樣性的真實(shí)情況。但目前通過高通量測(cè)序技術(shù)還無法分離AM真菌，只有通過孢子形態(tài)來分離鑒定AM真菌，所以保存AM真菌資源還離不開孢子形態(tài)學(xué)鑒定方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]王瑞，陳隆升，王湘南，等. 氮素形態(tài)對(duì)油茶苗木生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的影響[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，43（4）：26-32.

[2]徐煲鏵，羅麗君，李永泉，等. 粵北小坑鎮(zhèn)油茶林土壤養(yǎng)分狀況調(diào)查與評(píng)價(jià)[J].林業(yè)與環(huán)境科學(xué)， 2018，34（6）：44-50.

[3]黃鑫，張利軍，張保艷.油茶籽油提取方法對(duì)比分析[J].中國油脂， 2019，44（6）：9-13.

[4]陳勁松，賴瓊瑋，黃閨，等.霉變油茶籽對(duì)壓榨油茶籽油的影響研究[J].中國油脂，2019，44（3）：99-101.

[5]柴宇星.祁連山陰陽坡叢枝菌根真菌多樣性及群落構(gòu)建機(jī)制研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2018.

[6]成斌，許偉，胡從從，等. 比較形態(tài)學(xué)、聚丙酰胺凝膠電泳與二代測(cè)序在AM真菌群落研究中的應(yīng)用[J].菌物學(xué)報(bào)， 2018，37（9）：1170-1178.

[7]王艷云，郭篤發(fā).黃河三角洲鹽堿地AM真菌多樣性[J].分子植物育種，2016，14（8）：2232-2238.

[8]成斌. 塞北荒漠羊柴AM真菌群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性研究[D].保定：河北大學(xué)，2017.

[9]張曉曉. 典型喀斯特地區(qū)土壤AM真菌多樣性及其影響因素研究[D]. 桂林：廣西師范大學(xué)，2018.

[10]RILEY D， BARBER S A. Bicarbonate Accumulation and pH Changes at the Soybean （Glycine max （L.） Merr.） Root￣Soil Interface1 [J]. Soil Science Society of America Journal，1969， 33（6）：905-908.

[11]袁騰，陶光耀，江龍.梵凈山4種林型的土壤叢枝菌根真菌多樣性[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018，46（3）：83-86.

[12]VAN GEEL M， BUSSCHAERT P， HONNAY O， et al. Evaluation of six primer pairs targeting the nuclear rRNA operon for characterization of arbuscular mycorrhizal fungal （AMF） communities using 454 pyrosequencing[J]. Journal of Microbiological Methods， 2014，106： 93-100.

[13 ]蔣勝競(jìng).幾種環(huán)境因子對(duì)高寒草甸AM真菌群落結(jié)構(gòu)與功能的影響研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)， 2018.

[14]WU Q， SUN P， Srivastava A K. AMF diversity in citrus rhizosphere[J]. Indian Journal of Agricultural Sciences， 2017，87（5）： 653-656.

[15]覃曉娟，廖楠，張金蓮，等. 廣西紅壤區(qū)甘蔗根際土壤叢枝菌根真菌種類的18S rDNA基因序列分析鑒定及多樣性分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào)， 2018，39（11）：2241-2249.

[16]王幼珊，張美慶，邢禮軍，等. 我國東南沿海地區(qū)的VA菌根真菌 Ⅰ.四種硬囊霉[J].真菌學(xué)報(bào)， 1996，15（3）：161-165.

[17]羅協(xié)，婁婭，崔菁苗，等. 三峽庫區(qū)消落帶常見野生植物AM真菌[J].菌物學(xué)報(bào)， 2016，35（7）：822-832.

[18]劉潤(rùn)進(jìn)，焦惠，李巖，等. 叢枝菌根真菌物種多樣性研究進(jìn)展[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2009，20（9）：2301-2307.

（責(zé)任編輯：周曉南）

Diversity Survey of AM Fungi in Rhizosphere

Soil of Wild Camellia oleifera

ZHOU Guangrong， SHANG Kun， JIANG Long*

（College of Life Sciences/ Key laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation

in Mountainous Region （Ministry of Education）， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract：

In order to explore the species compositionand diversity of AM fungi in rhizosphere soil of wild Camellia oleifera， three wild Camellia oleifera rhizosphere soils were collected for the isolation and morphological identification of AM fungi， and the soil DNAs were extracted and sequenced by high￣throughput sequencing. The results show that six AM fungal species belonging to 3 genera were identified by morphology， including Sclercystis Taiwanensis， Sclercystis rubiforme， Glomusflavisporum， Glomus dolichosporum， Acaulospora mellea and Acaulospora koskei. High￣throughput sequencing identified 42 species of AM fungal from 6 genera including Glomus， Archaeospora， Claroideoglomus， Acaulospora， Paraglomus， Diversispora， among which 36 VT species. VTX00166 and Glomus were the dominant species and dominant genus of AM fungi in rhizosphere soil of wild Camellia oleifera.High￣throughput sequencing can detect more AM fungal species than morphological identification.

Key words：

Camellia oleifera; AM fungi; high￣throughput sequencing; diversity