視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤miRNA-215和Rb1蛋白表達(dá)及意義

[摘要]目的 探討視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織microRNA-215（miRNA-215）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb1蛋白）表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性。方法 選取視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤病人65例（73眼）手術(shù)切除的癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織，采用RT-PCR法檢測(cè)兩者miRNA-215表達(dá)、Western blot方法檢測(cè)兩者Rb1蛋白水平，并分析miRNA-215與Rb1蛋白相關(guān)性及二者與病人臨床病理特征的相關(guān)性及預(yù)后的關(guān)系;進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，采用噻唑藍(lán)比色法（MTT）、Caspase-3活性檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)分析miRNA-215類(lèi)似物及miRNA-215抑制物對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Y79細(xì)胞）活力、增殖及凋亡的影響。結(jié)果 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤腫瘤組織中miRNA-215的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，Rb1蛋白表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，差異有顯著性（t=-14.14、92.80，Plt;0.01）。分化型腫瘤組織中miRNA-215表達(dá)低于未分化型，Rb1蛋白表達(dá)高于未分化型;伴隨神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人腫瘤組織中miRNA-215表達(dá)高于未出現(xiàn)神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人，Rb1蛋白表達(dá)低于未出現(xiàn)神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人（t=-55.30～344.30，Plt;0.05）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，miRNA-215類(lèi)似物能顯著升高Y79細(xì)胞中miRNA-215的表達(dá)水平并導(dǎo)致細(xì)胞活力升高、增殖能力增強(qiáng)及凋亡細(xì)胞百分比降低，同時(shí)顯著降低細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白表達(dá)水平;miRNA-215抑制物則顯著降低Y79細(xì)胞中miRNA-215的表達(dá)水平并導(dǎo)致細(xì)胞活力降低、增殖能力下降、胞內(nèi)Caspase-3活性增加及凋亡細(xì)胞百分比增加，同時(shí)升高細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白表達(dá)水平，差異有顯著性（F=148.5～3 938.0，Plt;0.01）。結(jié)論 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中miRNA-215和Rb1蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征相關(guān)，可作為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤;miRNA-215;視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì);病理學(xué)，臨床

[中圖分類(lèi)號(hào)]R739.72

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2019）05-0586-05

doi：10.11712/jms201905020

[開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是一種較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，多發(fā)生于視網(wǎng)膜核層，具有一定的家族傾向，常發(fā)生于5 歲以下的小兒，且容易發(fā)生顱內(nèi)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅病兒的生命健康[1-2]。探討視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)病的分子機(jī)制并尋找早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的診治水平和改善病兒預(yù)后具有重要意義[3-4]。已有研究表明，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展與基因突變、表觀遺傳修飾等多種分子機(jī)制有關(guān)，而視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb1蛋白）可能在這一過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用[5-6]。Rb1是一種抑癌蛋白，在肺癌、胃癌、乳癌等多種癌癥中存在失活情況;而microRNA-215（miRNA-215）在多種腫瘤組織中均異常表達(dá)，其在腫瘤增殖、遷移及侵襲等多種病理過(guò)程中均發(fā)揮著重要功能[8-9]，但其能否抑制Rb1 蛋白的表達(dá)目前尚不明確。本研究探討視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織miRNA-215的表達(dá)特點(diǎn)及其與Rb1蛋白水平及臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年1月—2014年12月，選取在我院眼科行手術(shù)摘除眼球治療并經(jīng)病理診斷為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤病人65例（73眼），男25例，女40例;年齡5.0個(gè)月～8.5歲，平均（3.9±0.9）歲;分化型25眼，未分化型48眼;發(fā)生神經(jīng)浸潤(rùn)38眼，未發(fā)生神經(jīng)浸潤(rùn)35眼;出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。所有病兒術(shù)前均未接受化療及局部放療等治療。本研究獲得病人監(jiān)護(hù)人知情同意及醫(yī)院的倫理學(xué)審核通過(guò)。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 RT-PCR檢測(cè)miRNA-215表達(dá) 取病人手術(shù)切除的腫瘤組織及癌旁正常組織各50 mg，應(yīng)用Trizol提取組織和細(xì)胞中總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為DNA，在聚合酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增，引物及其序列見(jiàn)表1。

取擴(kuò)增后的產(chǎn)物，利用熒光定量PCR儀（AB 7500cx）定量檢測(cè)miRNA-215水平。Trizol提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購(gòu)自美國(guó)AB公司，具體檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2 Western blot檢測(cè)Rb1蛋白表達(dá) 取手術(shù)切除的腫瘤組織及癌旁正常組織各75 μg，以100 g/L十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，分離后轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45 μm的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，置于50 g/L脫脂奶粉中封閉2 h;加入一抗（1∶1 000稀釋的Rb1多克隆抗體）后4 ℃孵育過(guò)夜，以體積分?jǐn)?shù)0.005的TBS-T溶液洗膜3次后再加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000）進(jìn)行反應(yīng)，以體積分?jǐn)?shù)0.005的TBS-T溶液洗膜3次，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，并應(yīng)用圖像軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目標(biāo)蛋白與β-actin的灰度比值。

1.2.3 miRNA-215蛋白檢測(cè) 培養(yǎng)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞，穩(wěn)定傳代2～3代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將miRNA-215表達(dá)質(zhì)粒（miRNA-215 mi-mics）、miRNA-215抑制質(zhì)粒（miRNA-215 inhibitor）及其相應(yīng)的miRNA-215對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤系細(xì)胞，用培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后每孔加5 g/L的MTT溶液20 μL;孵育4 h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加DMSO溶液150 μL，靜置15 min后以酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度值，以其表示miRNA-215蛋白值。

1.2.4 BrdU檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于96孔板，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，加入20 μL BrdU標(biāo)記液繼續(xù)培養(yǎng)6 h。先加入Fix Denat使DNA變性，再加入100 μL HRP標(biāo)記的抗BrdU抗體，洗滌3次后加入100 μL的TMB底物液進(jìn)行顯色，20 min后加1 mol/L H2SO4Y終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光度值，此吸光度值即BrdU值[10]。

1.2.5 Caspase-3蛋白檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞加2.5 g/L胰酶進(jìn)行消化，1 000 r/min離心5 min后棄掉胰酶，以PBS洗滌細(xì)胞2次，再以2 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞沉淀;加入50 μL預(yù)冷的Lysis Buffer并置于冰上裂解20～30 min，隨后于4 ℃以10 000 r/min離心1 min。吸取上清液，應(yīng)用BCA法測(cè)定Caspase-3蛋白濃度，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，以PBS洗滌后1 000 r/min離心5 min，棄去上清，以Binding buffer重懸細(xì)胞并調(diào)整密度為1×109/L，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)[11]。上述每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)12次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 16.0和GraphPadPrism 5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料以[AKx-D]±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征對(duì)miRNA-215及Rb1蛋白表達(dá)影響

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤腫瘤組織miRNA-215表達(dá)顯著高于癌旁組織，Rb1蛋白表達(dá)顯著低于癌旁組織，差異有顯著性（t=14.14、92.80，Plt;0.01）。分化型腫瘤組織miRNA-215表達(dá)低于未分化型，而Rb1蛋白表達(dá)高于未分化型（t=-55.30、63.24，Plt;0.01）;有神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人腫瘤組織中miRNA-215表達(dá)高于無(wú)神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（t=-2.79、-76.18，Plt;0.01），Rb1蛋白表達(dá)低于未出現(xiàn)神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（t=344.30、80.56，Plt;0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 miRNA-215類(lèi)似物和抑制物對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞各指標(biāo)的影響

miRNA-215類(lèi)似物顯著上調(diào)miRNA-215表達(dá)水平，增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，降低細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性，減少Y79細(xì)胞凋亡百分比;miRNA-215抑制物顯著降低miRNA-215表達(dá)水平，減弱細(xì)胞增殖能力，提高細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性，增加細(xì)胞凋亡百分比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=148.5～3 938.0，Plt;0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是一種來(lái)源于光感受器前體細(xì)胞的惡性腫瘤，也是嬰幼兒眼病中性質(zhì)最嚴(yán)重、危害性最大的一種惡性腫瘤[12-13]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤常見(jiàn)于3歲以下兒童，具有家族遺傳傾向，可單眼、雙眼先后或同時(shí)罹患，易發(fā)生顱內(nèi)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常常危及病兒生命[14-16]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的臨床表現(xiàn)復(fù)雜，可表現(xiàn)為結(jié)膜內(nèi)充血水腫、角膜水腫、虹膜新生血管、玻璃體混濁、眼壓升高及斜視等[17-18]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的確切病因和具體發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，一般認(rèn)為與遺傳和病毒感染等因素有關(guān)，而位于13q14抑癌基因Rb1突變、失活可能是導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生的主要機(jī)制[19]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的危害較為嚴(yán)重，如何早期診斷及治療是提高治療效果、降低死亡率的關(guān)鍵[20]。MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)重要的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA分子，可調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化、代謝、凋亡和應(yīng)激等過(guò)程[21-22]。越來(lái)越多的研究表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程有著密切的關(guān)系，其中miRNA-215在多種腫瘤組織中均發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用[23]。也有研究表明，miRNA-215在胃癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯相關(guān)[24]，但目前對(duì)于miRNA-215與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生和發(fā)展關(guān)系的研究卻較少。

研究表明，miRNAs表達(dá)或功能異常與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系[25-26]。Rb1蛋白是一種腫瘤抑制蛋白，也是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程防止細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)直至其具備分裂條件，其與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系[27]。本文研究顯示，miRNA-215在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，而Rb1蛋白的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，且分化型組織miRNA-215表達(dá)高于未分化型，Rb1蛋白表達(dá)則低于未分化型，提示miRNA-215、Rb1在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起癌基因作用，且miRNA-215相對(duì)表達(dá)量越高，Rb1蛋白相對(duì)表達(dá)量越低，腫瘤的分化程度越高。進(jìn)一步分析顯示，有神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤病人腫瘤組織中miRNA-215蛋白表達(dá)高于未出現(xiàn)神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，而Rb1蛋白低于未出現(xiàn)神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示miRNA-215、Rb1蛋白有可能成為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

腫瘤細(xì)胞的活力和增殖能力增強(qiáng)以及凋亡的減弱是其重要的生物學(xué)特征，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)基礎(chǔ)[28-29]。本文結(jié)果顯示，上調(diào)miRNA-215蛋白表達(dá)水平后細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，而Y79細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)降低，凋亡細(xì)胞明顯減少;而下調(diào)miRNA-215表達(dá)水平可明顯減弱細(xì)胞增殖能力，提高細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性，增加細(xì)胞凋亡百分比，提示miRNA-215的表達(dá)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞活性以及凋亡有著密切的關(guān)系，其高表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞活性、減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展[30-31]。

本文研究結(jié)果還表明，miRNA-215抑制物能顯著提高Y79細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白的表達(dá)，而miRNA-215類(lèi)似物能顯著降低Y79細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白的表達(dá)，提示miRNA-215高表達(dá)可以顯著抑制Y79細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白的表達(dá)，而下調(diào)miRNA-215表達(dá)可以顯著提高Y79細(xì)胞內(nèi)Rb1蛋白的表達(dá)，這可能是miRNA-215參與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程的主要機(jī)制，但其具體作用機(jī)制仍需做進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，miRNA-215在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮癌基因作用，其通過(guò)調(diào)控Rb1蛋白的表達(dá)影響視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生以及發(fā)展，miRNA-215有可能成為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）