電刺激法評價1型糖尿病小鼠勃起功能的應(yīng)用效果

[摘要]目的 探討電刺激陰莖海綿體神經(jīng)測定海綿體內(nèi)壓法（簡稱電刺激法）在1型糖尿病小鼠模型勃起功能障礙評價中的應(yīng)用效果。方法 將30只SPF級8周齡C57BL6J小鼠隨機(jī)分為對照組（n=10）和實驗組（n=20），實驗組小鼠給予腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)1型糖尿病模型，隨機(jī)選取10只作為后續(xù)實驗對象。8周后，電刺激小鼠陰莖海綿體神經(jīng)，記錄勃起時的海綿體內(nèi)壓最大值（ICPmax），間隔10 min，重復(fù)測量3次。記錄電刺激之前小鼠的平均系統(tǒng)血壓（MSBP），使用ICPmax/MBSP評估小鼠的勃起功能。結(jié)果 實驗組3次測得的ICPmax和ICPmax/MBSP差異無顯著性（Pgt;0.05），對照組3次測得的值差異也無顯著性（Pgt;0.05），但兩組組間每次測得的ICPmax和ICPmax/MBSP差異均有顯著性（t=17.71～18.27，Plt;0.05）。結(jié)論 在1型糖尿病小鼠模型中，應(yīng)用電刺激法測量海綿體內(nèi)壓是一種安全、穩(wěn)定、可重復(fù)的理想方法。

[關(guān)鍵詞]糖尿病，1型;陰莖勃起;電刺激;小鼠

[中圖分類號]R698.1;R587.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號] 2096-5532（2019）05-0528-04

doi：10.11712/jms201905006

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

勃起功能障礙（ED）是指陰莖持續(xù)不能達(dá)到和（或）維持足夠勃起以獲得滿意的性生活[1]。有調(diào)查結(jié)果顯示，在40～69歲的人群中ED的發(fā)病率高達(dá)52%[2]。ED是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，目前全球范圍內(nèi)的糖尿病病人約有3億5 000萬[3]，而高達(dá)75%的糖尿病病人有不同程度的ED，且發(fā)病年齡比普通人群提前10～15年，并隨著年齡和病程的增長而加重[4]。目前我國人口正呈現(xiàn)老齡化趨勢，因此老年男性糖尿病病人ED的防治越來越受到關(guān)注。如何有效評價糖尿病性ED的海綿體內(nèi)壓，是對其后續(xù)治療的有力保障。國外常用的評價勃起功能的方法是電刺激陰莖海綿體神經(jīng)測定海綿體內(nèi)壓法（簡稱電刺激法），而國內(nèi)運用此方法的報道不多，且研究對象多為大鼠。目前1型糖尿病小鼠模型的建立已經(jīng)成熟，本研究就該方法在1型糖尿病小鼠模型ED評價中的應(yīng)用效果進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡SPF級C57BL6J小鼠30只，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司（經(jīng)山東省實驗動物中心質(zhì)檢合格）。多導(dǎo)生理記錄儀、鉑金雙極電極、電刺激儀（美國BIOPAC公司），Visitech Systems BP-2000小動物無創(chuàng)血壓分析系統(tǒng)（美國INC公司），鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司），解剖顯微鏡及顯微手術(shù)器械（德國徠卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與建模 實驗小鼠飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心的SPF級動物房，隨意取食物和水，飼養(yǎng)環(huán)境：光/暗周期12 h/12 h，室溫（22±2）℃，濕度50%～55%。隨機(jī)選擇10只小鼠，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食、自由飲水，設(shè)為對照組;余20只小鼠設(shè)為實驗組，給予高脂飲食、自由飲水，腹腔注射STZ（用pH值4.5的0.1 mol/L冰檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制20 g/L的STZ溶液，注意避光，即配即用）50 mg/（kg·d），連續(xù)5 d，8周后測禁食10 h后的空腹血糖濃度，高于16.7 mmol/L者即為1型糖尿病建模成功[5]，從中隨機(jī)選取10只進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 小鼠勃起功能實驗 以6 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠（66～80 mg/kg），將小鼠仰面固定于動物解剖操作臺上。剃去小鼠下腹部手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，沿陰莖縱軸剪開陰莖包皮，分離包皮和白膜，充分暴露陰莖海綿體。取陰莖包皮切口向上延續(xù)2～3 cm，切開皮膚及腹壁，打開腹膜，用紗布條攢成球擠開腸道，增加手術(shù)操作空間。分離恥骨聯(lián)合前肌肉組織，充分暴露前列腺，在前列腺后外側(cè)，識別盆神經(jīng)節(jié)，沿尿道方向?qū)ぜ瓣幥o海綿體神經(jīng)，從底部穿過鉑金雙極電極并固定妥當(dāng)。用充滿肝素生理鹽水的頭皮針穿入陰莖海綿體中部，頭皮針通過三通閥門連接注射器和壓力換能器，推注少許肝素生理鹽水可見陰莖勃起，證明穿刺連接正確，術(shù)畢。

1.2.3 觀察指標(biāo) 電刺激小鼠的陰莖海綿體神經(jīng)，兩組給予相同強(qiáng)度的電刺激：電壓1或5 V，波寬1 ms，頻率13 Hz，刺激時間60 s，間隔10 min，共刺激3次[6]。記錄小鼠陰莖勃起時海綿體內(nèi)壓最大值（ICPmax）。在電刺激之前用Visitech Systems BP-2000無創(chuàng)尾壓測量系統(tǒng)檢測兩組小鼠血壓[7]。計算ICPmax/平均系統(tǒng)血壓（MSBP）。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，實驗所得計量數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以Plt;0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

實驗組小鼠體質(zhì)量明顯低于對照組、隨機(jī)血糖和空腹血糖顯著高于對照組（t=13.40～35.70，Plt;0.05），而兩組血壓比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。見表1。兩組MSBP比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。給予小鼠電刺激后，海綿體內(nèi)壓迅速升高，持續(xù)電刺激期間，壓力先是迅速增加，然后進(jìn)入平臺期，增加的幅度減弱，電刺激60 s時壓力達(dá)到最大值，停止電刺激，壓力迅速降低，恢復(fù)到基礎(chǔ)值左右。每組小鼠3次電刺激測量的ICPmax和ICPmax/MBSP差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），而兩組組間每次測得的ICPmax和ICPmax/MBSP差異均有顯著意義（t=17.71～18.27，Plt;0.05）。見表2。

3 討論

ED是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，5型磷酸二酯酶（PDE5）抑制劑是目前治療ED的常用藥物，但其對糖尿病病人的有效率要遠(yuǎn)低于非糖尿病病人[8]。其他治療如海綿體內(nèi)注射血管活性物質(zhì)、尿道內(nèi)栓劑、陰莖假體植入等方式[9]，能獲得一定效果，但均不理想。因此需要更深入地研究1型糖尿病ED的發(fā)病機(jī)制及探索有效的新治療方式。以病人為研究對象進(jìn)行性功能研究因為受到倫理、道德、法律等限制，無法開展基礎(chǔ)實驗的研究，目前多是以動物模型作為實驗基礎(chǔ)[10]。因此，選擇合適的實驗對象建立1型糖尿病模型，并在此基礎(chǔ)上開展ED的生理、病理生理和藥理學(xué)等各方面的研究，是將實驗結(jié)果安全有效地外推到人體應(yīng)用的保障。

在ED研究中，選擇合適的實驗動物需要考慮諸多因素，根據(jù)研究者的目的、動物成本、動物繁殖周期等因素，可以考慮貓、狗、兔、大鼠、猴等動物，小鼠近來也用于研究[11]。目前國內(nèi)最常用來研究糖尿病及其并發(fā)癥的實驗動物是大鼠，因為其具有抗感染能力強(qiáng)、繁殖快、易飼養(yǎng)、相對經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點[12]。但與小鼠相比，大鼠應(yīng)用于實驗所需的耗材及試劑仍然相對較多，因此國內(nèi)外對于糖尿病性ED的實驗研究越來越多地選擇小鼠作為實驗對象。

糖尿病動物模型的構(gòu)建方法主要有3種：實驗性糖尿病動物模型、自發(fā)性糖尿病動物模型和轉(zhuǎn)基因糖尿病動物模型[13]。其中自發(fā)性糖尿病動物模型因為繁殖飼養(yǎng)成本太高，其應(yīng)用受到一定限制，而利用基因敲除技術(shù)制備的轉(zhuǎn)基因糖尿病動物模型還未廣泛應(yīng)用，因此目前最常用的是實驗性糖尿病動物模型。最經(jīng)典的建立糖尿病動物模型的方法是腹腔或靜脈注射STZ，STZ通過特異性破壞動物胰島β細(xì)胞，引起胰島素合成釋放減少，進(jìn)而導(dǎo)致動物血糖升高[14]。STZ引起β細(xì)胞死亡的機(jī)制主要為：①烷化胰島β細(xì)胞DNA鏈，使其斷裂;②烷化一些細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶如ADP核糖體合成酶，導(dǎo)致ATP生成障礙，細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低，從而引起β細(xì)胞死亡[15]。STZ的溶液制劑不穩(wěn)定，pH值在3.5～4.5范圍之外，放置在常溫環(huán)境中會迅速降解，因此最好是用檸檬酸緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用，并置于冰盒上，在盡可能短的時間內(nèi)完成操作。

目前常用的注射方式是靜脈注射和腹腔注射，前者注射難度相對較高，容易出現(xiàn)操作誤差，而腹腔注射易操作、準(zhǔn)確、方便。程祎等[16]通過對比不同注射劑量的建模成功率和死亡率發(fā)現(xiàn)，STZ的注射劑量為60 mg/kg時，既能避免劑量過大引起器官損傷導(dǎo)致動物死亡，又能避免劑量過小而降低建模成功率、浪費實驗動物。

目前文獻(xiàn)報道的檢測、評價勃起功能的方法有陰莖海綿體測壓[17]、性行為直接觀察如阿撲嗎啡實驗[18]、勃起時肌電圖圖譜測量[19]、多普勒超聲檢測陰莖動脈血流變化[20]等。STEERS等[21]和CHEN等[22]分別以大鼠和小鼠為實驗對象成功測量了陰莖海綿體內(nèi)的壓力。對實驗動物勃起功能的檢測和[LL]評價要遵循客觀、準(zhǔn)確、簡單易行的原則，通過電刺激誘導(dǎo)陰莖勃起測量陰莖海綿體內(nèi)壓力的方法，因為能通過換能器直接讀取海綿體內(nèi)的壓力，不受外界環(huán)境和實驗者主觀因素的影響，能夠客觀、公正地評價陰莖勃起功能，成為國內(nèi)外評價陰莖勃起功能的標(biāo)準(zhǔn)方法。SEZEN等[23]首次報道了以電刺激法測量海綿體內(nèi)壓，并獲得成功。

本實驗參考國外相關(guān)文獻(xiàn)的電刺激參數(shù)[5]，以C57BL6J小鼠為實驗對象，在STZ誘導(dǎo)糖尿病模型成功后8周，電刺激小鼠陰莖海綿體神經(jīng)，比較兩組小鼠的海綿體內(nèi)壓，結(jié)果顯示糖尿病小鼠較對照組明顯下降，與既往研究結(jié)果一致。在實驗操作過程中，我們的經(jīng)驗是：小鼠的體積較小，生理解剖肉眼難辨，需要借助解剖顯微鏡和顯微手術(shù)器械，以減少對周圍組織和臟器的損傷，減少操作過程中出血，避免失血過多對實驗數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響;識別前列腺后外側(cè)的陰莖海綿體神經(jīng)時，可以用無菌棉球?qū)⒅車c管推開，提供充分的操作空間。

本研究利用電刺激法測量小鼠陰莖海綿體內(nèi)壓，兩組均連續(xù)給予3次電刺激，間隔10 min，得到的勃起功能指標(biāo)基本一致，無明顯變化，而兩組之間勃起功能指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明電刺激法能有效反映糖尿病小鼠與正常小鼠海綿體內(nèi)壓的差異，可以為1型糖尿病性ED提供評價的客觀依據(jù)?？傊?，電刺激法測量海綿體內(nèi)壓，應(yīng)用于小鼠糖尿病模型中安全、可靠、可重復(fù)，是一種理想的評價勃起功能的方法。

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（本文編輯 馬偉平）