青島地區(qū)HBV DNA陽性獻血者的血清學和分子生物學特征

[摘要]目的調查青島地區(qū)HBV DNA陽性獻血者病毒載量和血清學特征，并分析其HBV基因型。方法無償獻血樣本HBsAg-/HBV-DNA+32例，HBsAg+/HBV-DNA+7例，行高精度病毒載量檢測和補充血清學試驗，并通過S區(qū)擴增測序結合多對型特異性引物巢式PCR法分析HBV基因型。結果32例HBsAg-/HBV-DNA+樣本中，HBcAb+30例（93.75%），HBV DNA定量陰性17例，定量陽性15例;測序分型確定基因型4例為B型，其中1例發(fā)現兩處突變，分別為126位蘇氨酸/異亮氨酸（T/I）突變?yōu)楸彼幔ˋ）、175位亮氨酸（L）突變?yōu)榻z氨酸（S）。7例HBsAg+/HBV-DNA+樣本HBV DNA均定量陽性，確定基因型2例為B型，3例為C型。結論大部分HBsAg-/HBV-DNA+獻血者的HBcAb為陽性，HBV DNA呈低濃度，感染的HBV主要基因型為B型和C型。

[關鍵詞]供血者;乙型肝炎病毒;血清學試驗;遺傳學

[中圖分類號]R446.6[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0338-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the viral load， serological characteristics， and hepatitis B virus （HBV） genotype of HBV DNA-positive donors in Qingdao， China. MethodsA total of 32 HBsAg-/HBV-DNA+ blood samples and 7 HBsAg+/HBV-DNA+ samples were selected. High-precision viral load measurement and supplementary serological test were performed， and S-region sequencing combined with specific-primer nested PCR was used to analyze HBV genotype. ResultsAmong the 32 HBsAg-/HBV-DNA+ samples， 30 （93.75%） were HBcAb+; 15 had negative HBV DNA， and 17 had positive HBV DNA; sequencing and genotyping showed that 4 samples had genotype B， among which 1 was found to have two mutations， i.e.， 126 threonine/isoleucine （T/I） to alanine （A） and 175 leucine （L） to serine （S）. All 7 HBsAg+/HBV-DNA+ samples were positive for HBV DNA， among which 2 had genotype B and 3 had genotype C. ConclusionMost of the HBsAg-/HBV-DNA+ donors are positive for HBcAb， with a low concentration of HBV DNA， and genotypes B and C are the main genotypes for HBV infection.

[KEY WORDS]blood donors; hepatitis B virus; serologic tests; genetics

HBV是經輸血傳播疾病的病原體，乙肝表面抗原（HBsAg）是WHO認定的判斷HBV感染的關鍵指標[1-2]。目前，我國采供血機構主要采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和核酸擴增技術（NAT）方法對獻血者血液進行檢測，但由于HBV的復制特點以及疫苗和抗病毒治療的廣泛應用導致HBsAg突變率高，獻血者血液HBsAg檢測陰性卻存在低水平HBV DNA[3]。我國部分地區(qū)流行的HBV基因型主要為C型和B型，其次為D、E和A型[4-5]。但青島地區(qū)無償獻血者的HBV基因型分布未見報道。本文研究旨在了解青島地區(qū)HBsAg-/HBV-DNA+獻血者的病毒載量和血清學狀況，調查本地區(qū)HBV基因型和S基因突變情況，以期為青島地區(qū)HBV的認知和防控提供地域性的指導性意見。

1材料與方法

1.1血液樣本

根據青島市中心血站常規(guī)血液篩查模式，共篩選出無償獻血樣本39例納入實驗，樣本血清量均為3 mL以上，無明顯溶血和脂血。其中HBsAg-/HBV-DNA+樣本32例，HBsAg+/HBV-DNA+樣本7例。

1.2主要儀器

蓋立復Procleix TIGRIS核酸檢測系統(tǒng)（西班牙蓋立復公司）;Roche COBAS S201AmpliPre全自動核酸提取系統(tǒng)，Gene-Amp PCR system 9700型（美國ABI公司生產），CTM核酸擴增檢測系統(tǒng)，雅培Architect i2000SR化學發(fā)光分析儀，CG1-96型PCR儀（澳大利亞corbett公司），wide mini-sub cell GT電泳儀（美國Bio-Rad公司），Thermo LEGEND Micro 17型離心機，SORVALL Biofuge stratos 型離心機，ImageQuant350凝膠成像系統(tǒng)（美國GE公司生產）。

1.3主要試劑

AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV定量檢測試劑（第二代），雅培ARCHITECT HBsAg檢測試劑盒，雅培ARCHITECT HBsAg確認試劑盒（中和實驗），雅培ARCHITECT HBeAg檢測試劑盒，雅培ARCHITECT anti-HBe檢測試劑盒，雅培ARCHITECT anti-HBc檢測試劑盒，DNA聚合酶：KOD FX（TOYOBO），2×Taq PCR Master Mix（含染料）預混體系（天根公司），Expand High Fidelity PCR System（Roche Applied Science），血清/血漿病毒DNA提取試劑盒為QIAamp DNA blood mini kit （Qiagen， Hilden， Germany）。

1.4研究方法

常規(guī)篩查采用2次ELISA、1次NAT的篩查模式，各試劑均經中國藥品生物制品鑒定所鑒定批間合格并嚴格按照試劑盒說明書操作。對血清學任一試劑呈陽性反應的標本采用原試劑作雙孔檢驗（原血樣1孔，血袋小辮樣1孔），復檢1孔或2孔陽性者判為陽性。兩個核酸檢測平臺中，羅氏Cobas S201核酸檢測系統(tǒng)結果以CT值表示，Procleix Tigris核酸檢測系統(tǒng)（Grifol）結果以S/CO表示。

1.4.1高精度病毒載量檢測采用AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV定量檢測試劑進行HBV DNA病毒載量檢測，每份標本取1 mL，使用COBAS AmpliPrep儀器進行自動樣品制備，使用COBAS TaqMan分析儀進行自動擴增和檢測。

1.4.2補充血清學試驗采用雅培微粒子化學發(fā)光法進行HBsAg、乙肝表面抗體（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗體（HBeAb）、核心抗體（HBcAb）檢測。采用HBV HBsAg確認試劑盒（中和法）進行HBsAg確認檢測。

1.4.3HBV病毒DNA的提取應用QIAamp DNA blood mini kit進行DNA提取，提取的樣本量為200 μL，采用微量核酸含量測定儀測定DNA濃度，控制濃度為30～150 μg/L。

1.4.4PreS/S區(qū)基因的擴增根據HBV PreS/S基因區(qū)域內的保守序列設計半巢式PCR的引物S2812、S1194和B1051，引物由上海英俊公司合成。提取病毒核酸后PCR擴增PreS/S區(qū)，擴增時設置兩個陰性對照以避免出現假陽性，結束后取5 μL產物，經30 g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，應用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

1.4.5PCR擴增產物純化及測序將PCR擴增產物進行切膠純化，應用第二輪擴增引物作為測序引物進行雙向測序，用PreS/S區(qū)擴增產物來設計中間引物雙向測通。將測序結果存在雜合的樣本進行TA克隆，然后挑選單克隆進行測序。測序交由上海英俊公司使用ABI 3730 Genetic Analyzer測序儀（Applied Biosystems 公司）完成。測序結果用CLUSTAL_X（version 1.83）軟件進行序列比對，分析PreS區(qū)是否存在片段缺失以及T31C和T53C突變;分析S區(qū)是否存在與免疫逃逸、HBsAg檢測、anti-HBs和HBsAg結合能力改變相關的突變。

1.4.6HBV基因型和亞型系統(tǒng)發(fā)育分析分別應用MEGA 4（43）、Neighbor-joining計算法繪制進化樹，最適合模型采用MrModeltest 2.2（Nylander 2004）進行似然比檢驗。在進化模型檢驗的同時，還考慮了參數I和G，其中I是假設的不變位點的比例;G是Gamma分布;G+I指檢測數據集中有些位點是不變的，而可變位點的變異遵循Gamma分布速率模型。

2結果

2.1HBV DNA高精度病毒定量檢測

HBV DNA病毒載量檢測結果顯示，本文32例HBsAg-/HBV-DNA+樣本中，17例樣本為陰性，15例定量陽性，其中8例樣本HBV DNA<20 kU/L，7例>20 kU/L;7例HBsAg+/HBV-DNA+樣本均定量陽性，1例樣本HBV DNA<20 kU/L，6例>20 kU/L。

2.2乙肝補充血清學試驗

本文32例HBsAg-/HBV-DNA+樣本血清學檢測結果顯示，HBcAb+30例（93.75%），其中單獨HBcAb+ 者17例（53.13%），合并HBsAb+ 者7例（21.88%），HBsAg陽性者3例（9.38%）;而在7例HBsAg+/HBV-DNA+樣本中，HBsAg和HBcAb均陽性。見表2、3。

2.3HBV序列分析

經核酸提取和擴增，有9例樣本成功擴增和測序，6例為B型，3例為C型，其中4例為HBsAg-/HBV-DNA+樣本，經進化樹分析均為B型，其中2例血清學指標全陰性，1例HBsAb、HBcAb陽性，1例HBeAb陽性;5例為HBsAg+/HBV-DNA+樣本，經進化樹分析2例B型，3例C型。其中1例HBsAg-/HBV-DNA+樣本（8號）發(fā)現兩處突變，126位蘇氨酸/異亮氨酸（T/I）突變?yōu)楸彼幔ˋ），175位亮氨酸（L）突變?yōu)榻z氨酸（S）。見表4、圖1。

3討論

NAT能顯著縮短病毒檢測的窗口期，提高病毒的檢出率，降低輸血傳播病毒的殘余危險度[6-10]，2010年開始逐步應用于國內獻血者血液標本的篩查，大大降低了經輸血途徑傳播病毒的風險。本文采用羅氏核酸檢測系統(tǒng)和Grifol嚴格篩查青島市無償獻血者血液標本，32例被確證為HBsAg-/HBV-DNA+，DNA精確病毒載量檢測顯示17例定量陰性，15例定量陽性，其中8例HBV DNA<20 kU/L，7例>20 kU/L;而7例HBsAg+/HBV-DNA+樣本均定量陽性。原因可能是：①定量檢測標本經過低溫冷凍保存，復融的方法和速度以及運輸環(huán)節(jié)都可能影響病毒核酸的檢出;②現用的血液篩查系統(tǒng)是定性檢測系統(tǒng)，這與定量檢測系統(tǒng)的引物設計及檢測靈敏度不同，可能會導致檢測結果不一致;③血漿中的病毒顆粒呈泊松分布，加樣的隨機性可能導致結果的不同;④病毒載量太低或者核酸檢測假陽性[11]。本文結果顯示，HBsAg-/HBV-DNA+樣本的病毒載量顯著低于HBsAg+/HBV-DNA+樣本，而HBsAg-/HBV-DNA+獻血人員的HBV DNA均呈低濃度，大部分感染者的病毒載量均小于20 kU/L甚至檢測不出。

本研究補充血清學試驗顯示，32例HBsAg-/HBV-DNA+樣本中，HBsAg陽性3例（9.38%），說明現用ELISA試劑的靈敏度有待提高，或HBsAg區(qū)域的基因突變導致HBsAg的漏檢。除此之外，本文32例HBsAg-/HBV-DNA+樣本中，HBcAb+占93.75%，這部分獻血者處于感染窗口期或屬于隱匿性HBV感染，7例（21.88%）獻血者僅表現為HBsAb+，此類獻血者可能之前注射過疫苗但仍被病毒感染[12]。

根據HBV全基因組序列差異≥8%或S基因序列差異≥4%將HBV分為不同的基因型[13]，目前至少可以分為A～J等10種基因型，不同基因型的病毒復制以及逃逸宿主免疫力的能力不同，感染途徑和疾病進程也有所差異，從而導致不同地區(qū)HBV感染率和基因型分布的差異，基因型分布呈一定的地域性[5，14]。我國的HBV基因型主要是B型和C型，另外有少量的A型、D型及I型。本研究39例樣本中，有9例成功進行了測序分型，包括5例血清學陽性的標本（2例B型，3例C型）和4例HBV DNA單獨陽性的標本（4例B型）。4例HBV DNA單獨陽性的標本中，有3例HBcAb陽性，因此判定屬于隱匿性HBV感染（OBI），剩下的1例樣本為HBcAb陰性，但抗HBs為陽性，也屬于OBI的定義。楊愛蓮等[15]研究發(fā)現，10例OBI和3例窗口期全部屬于B型;葉賢林等[16]報道OBI感染者也以B型為主。林紅等[17]進行的研究發(fā)現，江蘇地區(qū)HBsAg-/HBV-DNA+獻血者的基因型以B型為主，其次是C型;而在乙肝血清學陽性的樣本中則B型、C型都有，是否提示B亞型的病毒更容易導致OBI？這可能還需要更大的樣本量來進行驗證。國外有研究表明，不同基因型HBV感染后病人的臨床表現、疾病進展、藥物治療應答與預后等有所不同[18-19]，如B基因型感染者往往呈現無癥狀的臨床狀態(tài)，這些感染HBV的獻血者誤認為自己是健康者而參與獻血[20]。與B型相比，C基因型HBV感染者出現更為嚴重肝臟疾病臨床表現的概率更大。

HBV S基因主要編碼HBsAg，包括T細胞和B細胞表位，是誘導機體產生中和抗體的蛋白基因。HBsAg的第124～147位氨基酸被稱為a決定簇，是最常見的變異發(fā)生部位，其誘導產生的HBsAb均可結合HBsAg并具有中和作用，是一種保護性抗體，其變異會使HBsAg的構型改變，導致病毒抗原性和免疫原性改變[21]，接種疫苗后不會產生保護性抗體[22];同時，變異株也會造成常規(guī)檢測方法的漏檢。本文39例血樣本經核酸提取和擴增，有9例成功擴增和測序，其中1例樣本126位T/I突變?yōu)锳，175位L突變?yōu)镾。編碼S基因的126位氨基酸突變可導致HBsAg的a決定簇發(fā)生改變，因此改變了抗原結構而造成HBV的漏檢，此突變與乙肝疫苗逃逸相關，說明該獻血者接種過乙肝疫苗，但由于感染的這個突變株病毒具有可以逃避疫苗的保護作用的突變，因此導致其仍然感染了HBV，而175位氨基酸突變的意義目前還不明確。KOYANAGI等[23]研究發(fā)現，氨基酸第129位天門冬氨酸和第145位丙氨酸的置換可以導致HBsAg檢測陰性，而X基因的突變可以對HBsAg的表達產生影響[24]，如果HBVa的決定簇及近鄰的位點發(fā)生變異，也會減弱抗體識別，從而導致常規(guī)試劑檢測陰性[25]。

雖然本文兩種方法的互補應用大大降低了輸血者感染HBV的風險，但由于部分HBV感染者的DNA水平非常低[26-29]，對現用核酸檢測系統(tǒng)的靈敏度提出了較高的要求，對輸血安全提出了挑戰(zhàn)[30]。日常檢測工作中，要加強檢測方法結果間的比較，對結果特殊的獻血者做進一步的追蹤隨訪。青島地區(qū)HBV感染以B和C型為主，但由于樣本量較小，今后要擴大研究范圍，對青島地區(qū)無償獻血者的HBV感染情況做更詳盡的調查研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）