miR-429對乳癌細胞增殖和遷移影響及其靶基因初步鑒定

[摘要]目的探討miR-429在人乳癌細胞系中的表達及其對細胞增殖和遷移的影響，初步鑒定miR-429的靶基因。方法采用實時熒光定量PCR（qPCR）方法檢測miR-429在人乳癌細胞系中的表達。通過MTT實驗和劃痕實驗確定miR-429對人乳癌細胞系MDA-MB-231細胞增殖和遷移的影響。采用生物信息學分析、qPCR和蛋白質印跡方法鑒定miR-429的靶基因。結果miR-429在人乳癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7中低表達。上調miR-429表達后，MDA-MB-231細胞增殖能力被顯著抑制（F=33.106，P<0.05），遷移能力明顯減弱（F=57.59，P<0.05）。過表達和抑制miR-429后，預測靶基因金屬蛋白酶2組織抑制劑（TIMP2）、環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白1（CREB1）mRNA表達水平均無明顯變化;然而，過表達miR-429后，TIMP2蛋白的相對表達量顯著降低（F=33.74，P<0.05）。結論在MDA-MB-231細胞中，過表達miR-429可抑制細胞增殖和遷移。miR-429的過表達可能通過轉錄后翻譯抑制TIMP2蛋白在MDA-MB-231細胞中的表達，初步鑒定TIMP2是miR-429的靶基因。

[關鍵詞]微RNAs;乳房腫瘤;細胞增殖;細胞運動;金屬蛋白酶2組織抑制劑

[中圖分類號]R737.9[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0325-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-429 （miR-429） in human breast cancer cell line and its effect on the proliferation and migration of human breast cancer cell， and to preliminarily identify the target genes of miR-429. MethodsQuantitative real-time PCR （qPCR） was used to measure the expression of miR-429 in human breast cancer cell line. MTT assay and wound healing assay were used to investigate the effect of miR-429 on the proliferation and migration of human breast cancer MDA-MB-231 cell line. bioinformatics analysis， qPCR， and Western blot were used to identify the target genes of miR-429. ResultsMiR-429 showed low expression in human breast cancer MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines. After upregulation of miR-429 expression， MDA-MB-231 cells had significant reductions in proliferative capacity （F=33.106，Plt;0.05） and migration ability （F=57.59，Plt;0.05）. There were no significant changes in the mRNA expression of the predicted target genes TIMP2 and CREB1 after miR-429 overexpression or inhibition; however， there was a significant reduction in the relative expression of TIMP2 protein after miR-429 overexpression （F=33.74，Plt;0.05）. ConclusionOverexpression of miR-429 may inhibit the proliferation and migration of MDA-MB-231 cell line and reduce the expression of TIMP2 protein in MDA-MB-231 cell line through post-transcriptional translation， and therefore， TIMP2 is preliminarily identified as the target gene of miR-429.

[KEY WORDS]microRNAs; breast neoplasms; cell proliferation; cell movement; tissue inhibitor of metalloproteinase-2

在世界范圍內，乳癌發(fā)病率位列女性惡性腫瘤之首，居癌癥死亡原因的第6位。目前乳癌的確診主要依靠空芯針穿刺和手術活檢，對病人創(chuàng)傷較大。影像學檢查和血液檢驗主要用于檢查乳癌病人腫瘤的復發(fā)轉移和耐藥，其靈敏度和特異度欠佳。因此，尋找在乳癌發(fā)生和進展過程中起關鍵作用的特異腫瘤標志物對于乳癌的診斷治療至關重要。微RNAs（miRNAs）是單鏈非編碼RNAs，20～25個核苷酸長度，屬于一類新的內源性干擾RNAs[1]。其通過與靶基因mRNA 3′非編碼區(qū)結合，對轉錄后基因沉默具有重要作用。miRNAs及其靶基因作為腫瘤標志物在乳癌發(fā)生和進展中的作用是目前研究的熱點。miR-429作為癌基因或抑癌基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。已有研究顯示，乳癌組織miR-429的表達較癌旁組織明顯減低。miR-429在不同人乳癌細胞系中的表達存在差異[3]。關于miR-429在人乳癌組織中的靶基因及其生物學功能研究較少，且存在一定的爭議。有研究結果證實，在人乳癌組織中，miR-429通過下調ZEB1、CRKL、LIMK1、PLCG1等靶基因的表達，參與腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等惡性生物學行為[4-6]，發(fā)揮抑癌作用。因此，探討miR-429在乳癌中的作用機制，關鍵是研究miR-429及其靶基因的作用。本研究旨在探討miR-429在人乳癌細胞系中的表達情況，以及miR-429過表達和抑制對人乳癌MDA-MB-231細胞增殖和遷移的影響，并初步鑒定miR-429的靶基因，為明確miR-429參與乳癌的作用機制及尋找乳癌診斷、治療的標志物提供實驗依據。現(xiàn)將結果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

人乳癌細胞系MCF-7（青島大學附屬醫(yī)院中心實驗室）;人乳房上皮細胞系MCF-10A、人乳癌細胞系MDA-MB-231（青島大學醫(yī)學部中心實驗室）;miR-429 mimics、mimics NC、inhibitors NC、miR-429 inhibitors、Cy3標記的mimics NC（上海吉瑪公司）;RIPA裂解液、BCA蛋白質定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;BI胎牛血清（青島博康生物科技有限公司）;DMEM/High Glucose培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）;MTT試劑（Sigma公司）;Trizol Reagent（Invitrogen公司）;TransIntroTM EL Trans-fection Reagent、熒光定量PCR Mix、反轉錄試劑盒、鼠抗人GAPDH抗體（北京全式金生物技術有限公司）;引物（上海桑尼生物科技有限公司）;兔抗人金屬蛋白酶2組織抑制劑（TIMP2）和環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白1（CREB1）抗體（恩晶生物）;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG（北京博奧森公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)細胞用含體積分數0.10胎牛血清、10 g/L青鏈霉素混合液的DMEM/High Glucose培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數生長期時用于后續(xù)實驗。

1.2.2細胞轉染和分組取生長狀態(tài)良好的細胞按每孔2×105接種于6孔板，待細胞匯合度達40%～60%時進行轉染。根據miRNA mimics和Trans-IntroTM EL Transfection Reagent轉染操作說明，用Cy3標記的mimics NC和TransIntroTM EL Transfection Reagent轉染試劑優(yōu)化轉染條件。轉染后12 h更換含血清培養(yǎng)液并于熒光顯微鏡下觀察轉染效率。最佳轉染條件為：mimics NC 12.5 μL、TransIntroTM EL Transfection Reagent 5 μL。細胞按轉染不同分為miR-429 mimics組（A組）、mimics NC組（B組）、control組（C組）、inhibitors NC組（D組）和miR-429 inhibitors組（E組）。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h用于后續(xù)實驗。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖活力取對數生長期細胞消化后接種于96孔板，每孔約6 000個細胞，每組設置5個復孔，共鋪4塊板。待細胞匯合度達到40%進行轉染。每天取一板細胞用MTT法檢測細胞增殖活力。從轉染12 h后開始檢測，每孔加入5 g/L的MTT 10 μL，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后棄去培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO溶解甲瓚顆粒。酶標儀設置震板5 min溶解甲瓚顆粒，檢測490 nm波長處各孔吸光度（A）值，以轉染后培養(yǎng)時間為橫軸、A值為縱軸制作細胞增殖曲線。

1.2.4細胞劃痕實驗取對數生長期細胞接種于6孔板，待細胞匯合度達到40%～60%時進行轉染，待細胞匯合度達到90%時進行劃痕實驗。分別于劃痕0、24 h時觀察細胞遷移情況并拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件計算劃痕面積，結果取3次重復實驗的均值。計算24 h劃痕愈合率[（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%]。

1.2.5生物信息學方法預測并篩選miR-429靶基因以miR-429為檢索詞，分別在miRanda、Targetscan和Pictar數據庫中篩選miR-429可能的靶基因，將至少兩個軟件都能預測到的基因作為其可能的靶基因。為了深入了解miR-429對乳癌細胞生物學功能的影響，將預測得到的miR-429靶基因進行GO富集分析，選擇富集了參與調控癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學行為的靶基因。通過miRNA CancerMap數據庫和文獻分析排除已驗證過的靶基因，最終選取TIMP2、CREB1、EDNRA、TUBB、DUSP1、MED13、LRP1、GDI2、GABPA、UBE2B、EPS8、MYCN、PLK2、OCLN等作為待測的miR-429靶基因。

1.2.6實時熒光定量PCR（qPCR）檢測細胞miR-429表達水平和預測靶基因mRNA表達水平將轉染miR-429 mimics、mimics NC、inhibitors NC、miR-429 inhibitors的MDA-MB-231和MCF-7細胞以及只加TransIntroTM EL Transfection Reagent的control組細胞分別用Trizol法提取總RNA，測定各組RNA濃度，根據A260/280值判斷RNA純度。各組RAN A260/280均在1.8～2.0區(qū)間內，純度較高。按照逆轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件如下：65 ℃、5 min，冰上孵育2 min;42 ℃、15 min，85 ℃、5 s。根據qPCR試劑盒說明配制反應體系。反應條件為：94 ℃、30 s; 94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)。各待測基因引物序列見表1。每組樣品至少設置3個復孔，實驗至少重復3次。以2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

1.2.7Western blot方法檢測細胞TIMP2蛋白的相對表達量將上述5組細胞棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，加入RIPA裂解，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。加入6×Protein Loading Buffer后煮沸5 min。在120 g/L SDS-PAGE分離膠+50 g/L濃縮膠的凝膠系統(tǒng)中電泳分離蛋白，然后將蛋白電轉轉移至0.45 μm的PVDF膜上。條帶用50 g/L的脫脂奶粉在搖床上室溫封閉2 h，用對應的1∶1 000稀釋的鼠抗人GAPDH抗體、兔抗人TIMP2抗體、兔抗人CREB1抗體在搖床上室溫孵育2.5 h，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。用對應的二抗室溫孵育1 h，重復TBST洗膜步驟，按說明配制ECL發(fā)光液并顯影。應用Fusion FX7成像系統(tǒng)拍照并分析，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0和Graphpad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料數據以±s表示，樣本間比較采用析因設計的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1miR-429對MDA-MB-231細胞增殖活力影響

miR-429表達情況與培養(yǎng)時間存在交互效應（F=5.941，P<0.05），miR-429表達對細胞增殖有顯著影響（F=33.106，P<0.05），從培養(yǎng)3 d開始各組的增殖水平開始出現(xiàn)差異（F=24.468、19.130，P<0.05）。培養(yǎng)3、4 d時miR-429 mimics組細胞增殖能力較control組、inhibitors NC組、miR-429 inhibitors組明顯減低（t=5.193～7.338，P<0.05），而miR-429 mimics組和mimics NC組細胞增殖能力無顯著差異（t=1.243、3.121，P>0.05）。見圖1。

2.2miR-429對MDA-MB-231細胞遷移能力影響

miR-429 mimics組、mimics NC組、control組、inhibitors NC組、miR-429 inhibitors組細胞的劃痕愈合率分別為0.101±0.043、0.139±0.010、0.413±0.020、0.416±0.066和0.361±0.064，miR-429的表達對MDA-MB-231細胞遷移能力有顯著影響（F=57.59，P<0.05）。組間兩兩比較，miR-429 mimics組和mimics NC組細胞遷移能力差異無顯著意義（t=1.199，P>0.05），miR-429 mimics組細胞遷移能力較control組、inhibitors NC組、miR-429 inhi-bitors組明顯減低（t=9.708～11.640，Plt;0.05）。

2.3miR-429在人乳癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7中的表達

與非致瘤的上皮細胞系MCF-10A相比，人乳癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7中miR-429的相對表達量分別為0.009±0.002（n=3）和0.007±0.002（n=4），差異均有統(tǒng)計學意義（t=921.264、1 233.490，Plt;0.05），結果表明miR-429在人乳癌MDA-MB-231和MCF-7細胞系中低表達。

2.4過表達或抑制miR-429后預測靶基因mRNA水平的變化

通過生物信息學結合文獻分析的方法得到預測靶基因TIMP2和CREB1。在MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞中分別過表達和抑制miR-429，采用qPCR檢測各靶基因的mRNA表達水平變化。與control組相比，在MDA-MB-231和MCF-7細胞中過表達和抑制miR-429，TIMP2和CREB1 mRNA相對表達水平無明顯變化（P>0.05）。見表2。

2.5miR-429對MDA-MB-231細胞中TIMP2蛋白表達的影響

miR-429 mimics組TIMP2蛋白表達明顯低于mimics NC組、control組、inhibitors NC組和miR-429 inhibitors組，差異有統(tǒng)計學意義（F=33.74，P<0.05）;而CREB1蛋白在各組細胞中的表達差異無統(tǒng)計學意義（F=2.557，P>0.05）。見表3。

3討論

目前，miR-429在乳癌中的生物學功能的研究較少。LI等[4]的研究結果表明，miR-429-5p通過LIMK1/CFL1通路顯著抑制人乳癌MDA-MB-231和HCC1937細胞的增殖、遷移、侵襲和轉移。秦科宇等[3]的研究表明，miR-429能夠顯著促進人乳癌Bcap37細胞的增殖和遷移。本研究采用qPCR方法檢測顯示，miR-429在人乳癌MDA-MB-231、MCF-7細胞系中特異性表達下調。miR-429 mi-mics組較control組和inhibitors NC組細胞增殖、遷移能力減低，說明過表達miR-429可明顯抑制人乳癌MDA-MB-231細胞增殖和遷移。這與LI等[4]的研究結果相一致。本文MTT和劃痕實驗結果顯示，miR-429 mimics組和mimics NC組細胞增殖和遷移能力無顯著差異，可能是因為mimics NC樣品不純。外源性補充miR-429 inhibitors對人乳癌MDA-MB-231細胞增殖和遷移能力無明顯影響，可能是由于單鏈miR-429 inhibitors對內源性miR-429抑制作用不顯著。miR-429在不同人乳癌細胞系中發(fā)揮不同作用，可能與該細胞系中miR-429及其靶基因表達譜相關，也可能與其所處的腫瘤微環(huán)境不同有關。

miR-429對TIMP2的靶向調控作用已經在肺癌A549細胞系中得到證實[7]。該研究結果顯示，miR-429在A549細胞中高表達，外源性過表達miR-429可顯著促進細胞增殖、遷移和侵襲。本文研究結果顯示，過表達miR-429的人乳癌MDA-MB-231細胞中，TIMP2蛋白表達水平明顯減低，而TIMP2 mRNA表達水平則無明顯變化，間接說明TIMP2是miR-429的靶基因，miR-429在蛋白質翻譯過程中下調TIMP2的表達。

TIMP2是一種基質金屬蛋白酶（MMP）抑制劑，被認為是腫瘤轉移的抑制因子。目前已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了TIMP2的表達失調[8-11]。有研究表明，TIMP2在乳癌[12-13]、卵巢癌[14]、肺癌[15]中呈高表達。TIMP2在體外降低生長因子介導的細胞增殖水平[16]，抑制新生血管生成和腫瘤生長[17]，不是通過抑制MMP的活性[16]。miR-429在腫瘤中的作用取決于TIMP2的多功能作用[18]。關于TIMP2在乳癌中抑癌作用的研究較少。本研究通過蛋白質印跡實驗證明，miR-429對TIMP2的抑制作用顯著。由本文MTT和劃痕實驗結果可推測，miR-429抑制細胞增殖和遷移并不全是通過下調TIMP2的表達而實現(xiàn)。

已有研究對miR-429在癌癥中的作用機制進行了探討。WANG等[19]研究結果表明，miR-429通過靶向TRAF6抑制NF-κB途徑進而抑制肝癌的進展。TANG等[20]研究表明，miR-429通過靶向抑制PTEN的表達，激活PI3K/AKT/GSK-3β信號轉導，導致β-連環(huán)蛋白的核轉位，降低β-連環(huán)蛋白的磷酸化水平，促進肝癌細胞的侵襲和遷移。CHEN等[21]研究結果表明，miR-429的過度表達通過抑制Wnt/β-catenin通路，抑制卵巢上皮癌細胞的侵襲和化學耐藥。生物信息學預測結果顯示，miR-429調控多個靶基因及信號通路。miR-429參與乳癌發(fā)生發(fā)展的機制尚不明確，乳癌中miR-429更多的靶基因及miR-429調控TIMP2發(fā)揮抑癌作用的機制尚需進一步研究。

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（本文編輯 馬偉平）