靶向肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721核酸適配體的篩選及鑒定

[摘要]目的以人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721作為混合靶標(biāo)篩選獲得特異性核酸適配體并對其進(jìn)行鑒定。方法以HepG2和SMMC-7721兩種人源肝癌細(xì)胞為篩選混合靶標(biāo)，利用細(xì)胞指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化（Cell-SELEX）技術(shù)篩選獲得核酸適配體。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測文庫富集情況，將富集文庫進(jìn)行克隆、測序，應(yīng)用RNA structure、MEME在線軟件進(jìn)行序列分析，再次通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定核酸適配體與靶標(biāo)的結(jié)合能力及特異性。結(jié)果通過10輪Cell-SELEX篩選得到核酸適配體10-8，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示核酸適配體10-8與人源肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721細(xì)胞結(jié)合，且特異性靶向肝癌細(xì)胞。結(jié)論篩選獲得與人源肝癌細(xì)胞系HepG2 和SMMC-7721雙靶標(biāo)特異性結(jié)合的核酸適配體10-8。

[關(guān)鍵詞]細(xì)胞指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù);癌，肝細(xì)胞;分子靶向治療;適體，核苷

[中圖分類號]R34[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0303-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo perform the screening and identification of specific aptamers targeting both HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells. MethodsCell-SELEX was used to screen out the aptamers targeting both human HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells. Flow cytometry was used to evaluate the enrichment of pools， and the enriched pool was then cloned and sequenced. RNA structure and MEME online software were used for sequence analysis， and flow cytometry was used to identify the binding capacity and specificity of candidate aptamers to targets. ResultsThe aptamer 10-8 was obtained after 10 rounds of Cell-SELEX. Flow cytometry showed that the aptamer 10-8 was bound to human HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cell lines and specifically targeted hepatoma cells. ConclusionThe aptamer 10-8 specifically binding to human HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells is obtained.

[KEY WORDS]Cell-SELEX; carcinoma， hepatocellular; molecular targeted therapy; aptamers， nucleotide

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因之一，對人類健康和生命構(gòu)成極大威脅[1-2]。據(jù)全球癌癥數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，中國肝癌病人數(shù)約占全球的50%[3-4]，肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌的70%～90%[5]。目前，肝癌治療的方法主要為手術(shù)切除、放療、化療以及幾種治療方法的聯(lián)合治療[6-7]。手術(shù)切除不徹底、復(fù)發(fā)率高和轉(zhuǎn)移率高等是影響肝癌治療效果的主要問題[8-9]。因此，從分子水平上發(fā)展分子靶向藥物及免疫治療藥物，可以大大提高肝癌病人的治療效果[10-11]。核酸適配體是一類具有特定結(jié)構(gòu)的單鏈DNA或RNA，其長度一般為20～80個堿基[12-13]。利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)，可以從隨機(jī)單鏈核酸序列庫中篩選出與靶標(biāo)特異性結(jié)合的核酸適配體[14]，而Cell-SELEX是在SELEX基礎(chǔ)上發(fā)展而來，以細(xì)胞為靶標(biāo)篩選獲得核酸適配體的技術(shù)[15]。核酸適配體與抗體作用相似，但又優(yōu)于抗體[16]。高特異性、高親和力的適配體具有靶分子范圍廣、性質(zhì)穩(wěn)定、制備方便、無免疫原性、成本低、便于保存運(yùn)輸、易在體外化學(xué)合成等優(yōu)點(diǎn)[17-19]，為惡性腫瘤的早期診斷和治療、腫瘤標(biāo)志物的篩選提供了一種全新有效的方法和手段[20]。目前，以肝癌細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行的適配體篩選均是以單一的某一種肝癌細(xì)胞為靶標(biāo)，尚未見以兩種或多種細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行的適配體篩選的報道。本研究以HepG2、SMMC-7721兩種肝癌細(xì)胞作為混合靶標(biāo)，應(yīng)用Cell-SELEX技術(shù)篩選特異性核酸適配體，期望獲得能靶向兩種肝癌細(xì)胞的核酸適配體，從而建立獲得廣泛靶向肝癌細(xì)胞靶標(biāo)的方法。同時，本文自適配體篩選第4輪結(jié)束后引入人源永生化正常肝細(xì)胞系L-02進(jìn)行消減篩選，排除適配體對正常細(xì)胞的影響，為后期通過適配體載藥進(jìn)行肝癌的基因治療時，更有效地減小毒副作用、提高腫瘤部位的局部藥物濃度奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞篩選靶細(xì)胞采用人源肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721（青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供）;消減篩選細(xì)胞為人源永生化正常肝細(xì)胞系L-02（購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）;特異性檢測細(xì)胞包括人源永生化乳腺細(xì)胞系HBL100、人源乳癌細(xì)胞MCF-7、人源大細(xì)胞性肺癌細(xì)胞H460、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞SW480及人源胃癌細(xì)胞MGC-803（青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供）。以上細(xì)胞均采用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清（美國Gibco公司）的高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）培養(yǎng)。

1.1.2文庫及引物初始文庫Gp30，由兩端的固定序列和中間30個nt的隨機(jī)序列組成，其中Pstemloop-tgatt劃線部分序列可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，與Plong-1 tgtc引物在PCR過程中阻止正鏈延伸，可產(chǎn)生不等長PCR產(chǎn)物[21]，從而制備單鏈次級文庫投入下一輪篩選。Plong-1 tgtc與P11-tgatt用于擴(kuò)增雙鏈產(chǎn)物，便于富集文庫克隆至pGM-T質(zhì)粒載體測序獲得單克隆序列。見表1。以上文庫、引物及FAM標(biāo)記適配體序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成、修飾。

1.2方法

1.2.1Cell-SELEX篩選ssDNA文庫（原始文庫或次級文庫）100 ℃變性5 min，立即冰浴10 min。加入篩選緩沖液各組分，最終孵育體系內(nèi)含有：1×PBS、1 mmol/L濃度MgCl2、0.1 g/L的酵母tRNA、0.1 g/L鮭魚精DNA和所需要的ssDNA文庫。將預(yù)先處理好的ssDNA文庫加入接種于96孔板的靶細(xì)胞（HepG2或SMMC-7721，每隔兩輪更換靶細(xì)胞，兩種靶細(xì)胞交替使用），4 ℃孵育30 min;吸棄上清，篩選洗滌緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2）輕柔洗滌3～4次;加入洗脫液（100 ℃雙蒸水），對結(jié)合在靶細(xì)胞上的ssDNA進(jìn)行洗脫;以洗脫液作為模板，利用Plong-1 tgtc和Pstemloop-tgatt進(jìn)行不等長PCR擴(kuò)增。完成4輪篩選之后，從第5輪引入消減篩選，在與靶細(xì)胞進(jìn)行篩選之前將孵育體系與消減細(xì)胞L-02在4 ℃孵育20 min，除去與L-02結(jié)合的適配體，將其余未結(jié)合的文庫與靶細(xì)胞孵育，進(jìn)行第5輪篩選。

1.2.2PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化PCR體系100 μL，內(nèi)含：10×PCR反應(yīng)緩沖液10 μL，dNTP混合物（每種核苷酸2.5 mmol/L）8 μL，Plong-1（25 μmol/L）1 μL，Pstemloop-3（25 μmol/L）1 μL，Taq DNA聚合酶（2.5×106 U/L）1 μL。加入2～3 μL洗脫液作為模板，為獲得雙鏈不等長的產(chǎn)物，采用莖環(huán)引物;為防止延伸階段莖環(huán)打開，設(shè)置PCR反應(yīng)條件為：94 ℃、30 s，45 ℃、30 s，58 ℃、30 s。自12個循環(huán)數(shù)開始至40個循環(huán)結(jié)束，每隔3個循環(huán)取10 μL產(chǎn)物，應(yīng)用含7 mol/L尿素的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，選取非特異性擴(kuò)增少、產(chǎn)物量剛達(dá)到平臺期的循環(huán)數(shù)作為大量擴(kuò)增的條件。

1.2.3ssDNA次級文庫的制備應(yīng)用含7 mol/L尿素的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后將正確大小的ssDNA條帶切膠，置于1.5 mL的EP管中。每管加入400 μL的凝膠洗脫液（其內(nèi)含有0.5 mol/L NH4AC，2 g/L SDS，1 mmol/L EDTA），37 ℃搖床上洗脫6 h以上。將凝膠洗脫液轉(zhuǎn)移到新管，加入1 mol/L MgCl2 4 μL、3 mol/L醋酸鈉（pH值5.2）40 μL和預(yù)冷的無水乙醇1 mL，混勻，于-70 ℃沉淀過夜。4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清;用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇1 mL洗滌，4 ℃、12 000 r/min離心30 min;棄上清，自然晾干。雙蒸水逐管潤洗回收ssDNA（回收的ssDNA使用 NanoDrop進(jìn)行質(zhì)量鑒定后投入次輪篩選）。

1.2.4克隆與測序?qū)⒔?jīng)過10輪篩選的適配體文庫擴(kuò)增為雙鏈后連接T載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coil DH5α中，隨機(jī)挑取60個適配體進(jìn)行克隆測序。運(yùn)用RNA structure軟件進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)繪圖并且通過MEME在線軟件（http：//meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi）進(jìn)行結(jié)構(gòu)同源性分析。選擇具有代表性的序列并進(jìn)行FAM標(biāo)記，與靶標(biāo)孵育后通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定序列對靶標(biāo)進(jìn)行識別，最終篩選獲得適配體序列。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)鑒定富集文庫將肝癌細(xì)胞HepG2用DMEM洗去死細(xì)胞，胰酶消化，離心，篩選洗滌緩沖液重懸，然后分別與用FAM標(biāo)記的引物Plong-1 tgtc擴(kuò)增獲得FAM標(biāo)記的第6輪、8輪、10輪文庫，4 ℃避光孵育10 min，離心后加入200 μL篩選洗滌緩沖液重懸。流式細(xì)胞儀檢測不同輪數(shù)文庫中可以結(jié)合靶標(biāo)的適配體富集程度。

1.2.6適配體10-8與篩選細(xì)胞結(jié)合鑒定應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證獲得的適配體與篩選細(xì)胞（靶細(xì)胞與消減細(xì)胞）的結(jié)合情況。同時以FAM標(biāo)記的原適配體庫Gp30作為對照，分別比較獲得的適配體、Gp30與不同細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度。

1.2.7獲得的適配體的特異性檢驗(yàn)核酸適配體對靶標(biāo)的特異性識別能力是其作為特異性分子識別探針的關(guān)鍵，因此本文檢測了獲得的適配體分別與多種不同細(xì)胞的結(jié)合情況。獲得的適配體分別與多種不同細(xì)胞系（人源永生化乳腺細(xì)胞系HBL100、人源乳癌細(xì)胞MCF-7、人源大細(xì)胞性肺癌細(xì)胞H460、人源胃癌細(xì)胞MGC-803、人源腸腺癌細(xì)胞SW480）孵育后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)合情況。同時用非靶細(xì)胞的人源肝癌細(xì)胞HCC-LM3進(jìn)行特異性鑒定。

2結(jié)果

2.1文庫富集程度

為鑒定文庫富集情況，利用FAM標(biāo)記引物擴(kuò)增、回收得到FAM標(biāo)記的第6輪、8輪、10輪次級文庫。以FAM標(biāo)記的原適配體文庫Gp30作為對照，分別與HepG2孵育，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測第6輪、8輪、10輪次級文庫與靶細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)果顯示，與原適配體文庫Gp30相比，第6輪、8輪、10輪次級文庫峰值右移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，顯示篩選至第6輪文庫已有一定程度富集，第10輪文庫得到進(jìn)一步富集（圖1）。

2.2Cell-SELEX篩選

利用Cell-SELEX篩選最終獲得適配體序列10-8，運(yùn)用RNA Structure 4.6軟件預(yù)測得到的其二級結(jié)構(gòu)見圖2。

2.3適配體10-8與篩選細(xì)胞結(jié)合鑒定

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，適配體10-8與肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721結(jié)合的熒光強(qiáng)度明顯比原適配體文庫Gp30強(qiáng)，波峰右移。人源永生化正常肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞與適配體10-8及原適配體文庫Gp30結(jié)合的熒光強(qiáng)度擬合曲線中，適配體10-8與原適配體文庫的熒光強(qiáng)度接近，波峰重疊，沒有明顯差異（圖3）。

2.4適配體的特異性

以細(xì)胞與核酸適配體孵育后產(chǎn)生的熒光超出閾值的百分比判斷核酸適配體與細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示，與靶標(biāo)人源肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721相比，適配體10-8與其他腫瘤細(xì)胞孵育后不結(jié)合，與非靶標(biāo)細(xì)胞的人源肝癌細(xì)胞HCC-LM3弱結(jié)合，表明篩選所得適配體10-8具有高特異性。見表2。

3討論

肝癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療對提高病人生存率具有重要意義，通過分子生物學(xué)的方法尋找特異識別肝癌細(xì)胞的適配體對于肝癌的早期診斷和靶向治療至關(guān)重要。以往的靶向肝癌細(xì)胞的適配體篩選都是以單一的某一種肝癌細(xì)胞為靶細(xì)胞[22-24]，本研究期望獲得能夠普遍靶向多種肝癌細(xì)胞的適配體，以HepG2、SMMC-7721兩種肝癌細(xì)胞作為混合靶細(xì)胞。HepG2細(xì)胞是經(jīng)典的、國際上公認(rèn)的肝癌細(xì)胞[25]，但裸鼠成瘤性稍差[26];SMMC-7721細(xì)胞為國內(nèi)建系細(xì)胞，成瘤性稍強(qiáng)[27-28]。從創(chuàng)新性和后期實(shí)用性的角度出發(fā)，本課題組應(yīng)用Cell-SELEX技術(shù)首次以HepG2和SMMC-7721兩種肝癌細(xì)胞為混合靶標(biāo)進(jìn)行特異性篩選，并以永生化的人源正常肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞進(jìn)行消減篩選。

Cell-SELEX是在未知靶物質(zhì)的情況下，篩選出特異性識別細(xì)胞的適配體。本文研究以HepG2、SMMC-7721兩種肝癌細(xì)胞每隔兩輪交替作為靶細(xì)胞篩選特異性適配體，經(jīng)過10輪篩選得到富集文庫，經(jīng)過克隆、測序得到60條單一適配體序列，運(yùn)用RNA Structure軟件進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測并且通過MEME軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)同源性分析，適配體序列的二級結(jié)構(gòu)以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主，且不同序列的莖環(huán)數(shù)目存在較大差異，莖環(huán)位置及大小也各不同，推測這樣的結(jié)構(gòu)是適配體與靶標(biāo)結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[29-30]。從測序的60條單一序列中選擇10條具有代表性的序列進(jìn)行FAM標(biāo)記，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行結(jié)合鑒定。同時，為降低非特異性適配體，在第4輪后引入消減細(xì)胞人源正常肝細(xì)胞系L-02。此外，進(jìn)行PCR反應(yīng)條件優(yōu)化對整個篩選過程至關(guān)重要，PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)多會增加非特異性擴(kuò)增。本研究篩選獲得一條適配體10-8，可以特異性識別HepG2和SMMC-7721兩種人源肝癌細(xì)胞，且不與消減細(xì)胞L-02結(jié)合。此外，對適配體10-8進(jìn)行種屬特異性鑒定發(fā)現(xiàn)，該適配體不與人源永生化乳腺細(xì)胞系HBL100、人源乳癌細(xì)胞MCF-7、人源大細(xì)胞性肺癌細(xì)胞H460以及人源結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480特異性結(jié)合，與人源胃癌細(xì)胞MGC-803結(jié)合弱，說明該適配體具有良好的細(xì)胞種屬特異性。將適配體10-8與另一種非靶細(xì)胞的人源肝癌細(xì)胞HCC-LM3進(jìn)行結(jié)合鑒定發(fā)現(xiàn)，該適配體也可以特異性識別HCC-LM3細(xì)胞。

目前，尚未見以兩種或多種細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行的適配體篩選的報道，本研究以兩種肝癌細(xì)胞作為混合靶標(biāo)，篩選獲得特異性核酸適配體10-8。由此，我們認(rèn)為適配體10-8可能是一種可特異性靶向肝癌的適配體，這對特異性檢測肝癌細(xì)胞或治療藥物靶向投遞具有參考價值。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）