響應(yīng)面法優(yōu)化鰹魚(Katsuwonus pelamis) 內(nèi)臟魚油酶法提取工藝

, ,,,,

(1.浙江國際海運職業(yè)技術(shù)學院,浙江舟山 316021; 2.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院,浙江舟山 316022)

魚類內(nèi)臟是魚類精深加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物之一,對魚類內(nèi)臟進行綜合利用,不僅可以使資源得到充分利用,提升魚體本身經(jīng)濟價值,還可以減少廢水廢物的排放,對保護環(huán)境有著積極意義。魚類內(nèi)臟含有豐富的魚油,魚油中主要成分DHA和EPA等多不飽和脂肪酸的含量豐富[1],是很好的蛋白質(zhì)來源,并且是便于人體吸收利用的健康食品[2-4],對人體正常發(fā)育和保持健康有著重要意義,可預(yù)防和治療多種疾病[5-6]。幼兒及青少年及時補充DHA和EPA,可促進視力以及智力發(fā)育,中老年人及時補充可預(yù)防延緩由衰老所帶來的一系列疾病[7-9]。

鰹魚(Katsuwonuspelamis)是全球金槍魚漁業(yè)中重要的目標魚種之一[10-11]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織資料統(tǒng)計,鰹魚的產(chǎn)量約占世界主要金槍魚總產(chǎn)量的40%以上[12]。高頤雄[13]發(fā)現(xiàn)扁舵鰹的總脂肪高達13.2%,且n-3多不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)最高為2.62%。也有研究報道,鰹魚等大型洄游性魚的內(nèi)臟中含有30%～40% DHA以及5%～10%EPA[14-15]。

目前,越來越多的國內(nèi)外專家學者正在研究鰹魚內(nèi)臟不同酶解條件以及酶解產(chǎn)物的功能特性,以及鰹魚魚油萃取和精煉技術(shù)。酶解法是利用蛋白酶水解破壞蛋白質(zhì)和脂肪之間的結(jié)構(gòu)釋放油脂[16]。郝淑賢等[17]以鱘魚內(nèi)臟為原料,通過堿性蛋白酶對鱘魚內(nèi)臟進行酶解,研究了枯草桿菌酶法提取鱘魚魚油的工藝條件,比較不同提取方法對魚油品質(zhì)的影響。郝記明等[18]研究從羅非魚副產(chǎn)物中提取魚油的工藝,以魚油提取率為指標,考察中性蛋白酶的最佳提取條件,利用中性蛋白酶進行酶解時魚油提取率提高。湯小會[19]以竹家魚加工副產(chǎn)物為原料,采用蒸煮法和胰蛋白酶酶解兩種方法提取魚油,以提取率和感官評分為考察指標,分別對兩種提取工藝參數(shù)進行了優(yōu)化研究,實驗表明胰蛋白酶酶解法明顯比蒸煮法好。吳祥庭[20]采用中性蛋白酶提取鮐魚魚油,利用響應(yīng)面優(yōu)化分析法對酶法鮐魚最佳酶解工藝參數(shù)進行研究,得出最佳酶法水解條件為酶量為1000 U/g原料、pH7.3、45 ℃。洪鵬志等[21]考察木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解金槍魚頭蛋白,確定了金槍魚頭的蛋白水解條件?？傊?不同種類蛋白酶對不同魚類魚油提取率的影響有所不同,采用酶解法提取鰹魚魚油時,酶的種類的選擇及其最佳酶解工藝有待進一步研究。

酶法提取可溫和且有效保護油脂組分,能夠充分釋放原料中的油脂,從而提高魚油品質(zhì)和魚油提取率[22],該工藝條件對鱘魚內(nèi)臟魚油的提取效果明顯好于氨法、鉀法和蒸煮法,酶解后的物質(zhì)還可進一步加工用于食品或飼料工業(yè),工藝操作簡單,生產(chǎn)安全性高,是一種低投資、無污染的生產(chǎn)技術(shù)。本研究以鰹魚內(nèi)臟為原料,以魚油提取率為指標,由五種蛋白酶中選取酶解效果最佳的蛋白酶,以期得到提取鰹魚內(nèi)臟魚油時的最佳工藝條件,為鰹魚內(nèi)臟的綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰹魚內(nèi)臟 由浙江興業(yè)集團有限公司提供,-18 ℃冷凍儲藏;乙醇、鹽酸、石油醚、冰醋酸和氫氧化鈉(均為分析純)、胰蛋白酶(50000 U/g)堿性蛋白酶(30000 U/g) 購自國藥化學試劑有限公司；胃蛋白酶(30000 U/g)、木瓜蛋白酶(10000 U/g)、風味蛋白酶(50000 U/g) 購自武漢市華順生物科技公司。

101A型電熱鼓風干燥箱 上海浦東躍興科學儀器廠;DK-16型恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;FA24S型電子分析天平 上海天平儀器廠公司;F20K型pH計 上海精密儀器有限公司;NZ-100型高速均質(zhì)機 上海愛朗儀器有限公司;SHA-C型水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司;98-1-B型電子調(diào)溫電熱套 天津泰斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚油提取工藝 將冷凍鰹魚內(nèi)臟取出解凍,清洗干凈,用高速均質(zhì)機打碎至糊狀,-18 ℃冷凍備用。按一定液固比(g/g)加入蒸餾水打漿,加入稀鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH,加入相應(yīng)的蛋白酶開始酶解,一段時間后結(jié)束酶解,沸水浴10 min滅酶,冷卻后離心(5000 r/min,20 min)。取上清液,分離得到魚油。

1.2.2 魚油提取率的測定 粗脂肪含量根據(jù)GB/T 24870-2010 糧油檢驗大豆粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量的測定。

式中:R為魚油提取率(%),m1為所得魚油質(zhì)量,m2原料中粗脂肪含量。

1.2.3 最適酶的選擇 以魚油提取率為評價指標,采用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶在其各自最適溫度(反應(yīng)溫度)與pH下對鰹魚內(nèi)臟進行酶解,上述不同種類蛋白酶的反應(yīng)溫度和pH見表2。同時酶添加量為2%,液固比為1∶1,酶解時間為5.5 h,選擇酶解魚油最合適的蛋白酶。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 酶解時間對魚油提取率的影響 取酶解時間為4、4.5、5、5.5、6、6.5 h,其他酶解條件為液固比1∶1 (g/g,下同)、pH8.5、溫度55 ℃、酶添加量2%,考察鰹魚內(nèi)臟魚油的提取率。

1.2.4.2 酶解溫度對魚油提取率的影響 酶解溫度為45、50、55、60、65 ℃,其他酶解條件為液固比1∶1、pH8.5、時間5.5 h、酶添加量2%,考察鰹魚內(nèi)臟魚油的提取率。

1.2.4.3 酶添加量對魚油提取率的影響 取酶添加量為1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%,其他酶解條件為液固比1∶1、pH8.5、溫度55 ℃、時間5.5 h,考察鰹魚內(nèi)臟魚油提取率的變化。

1.2.4.4 pH對魚油提取率的影響 取pH為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5,其他酶解條件為液固比1∶1、溫度55 ℃、時間5.5 h、酶添加量2%,考察鰹魚內(nèi)臟魚油的提取率。

1.2.4.5 液固比對魚油提取率的影響 取液固比為0.4∶1、0.7∶1、1∶1、1.3∶1、1.6∶1，其他酶解條件為溫度55 ℃、時間5.5 h、pH8.5、酶添加量2%,考察鰹魚內(nèi)臟魚油的提取率。

1.2.4.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 堿性蛋白酶酶解響應(yīng)面優(yōu)化實驗因素和水平表見表1,通過堿性蛋白酶單因素試驗的結(jié)果分別選取酶添加量(A)、pH(B)和液固比(C)三個因素并設(shè)立三個水平進行鰹魚內(nèi)臟魚油提取工藝的優(yōu)化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及作圖采用Origin 8.1、SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件,采用SNK法分析測驗顯著性水平,p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的選擇

采用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶在其各自最適溫度與pH下對鰹魚內(nèi)臟進行酶解,不同蛋白酶對魚油提取率的影響如表2所示。除胃蛋白酶(28.25%)外,其余蛋白酶的魚油提取率均超過了40%,提取率最高的蛋白酶是堿性蛋白酶為57.46%,因此,選用堿性蛋白酶作為提取鰹魚內(nèi)臟魚油的蛋白酶。

表2 不同種類蛋白酶對鰹魚內(nèi)臟的酶解效果Table 2 The enzymolysis effect of different kinds of proteases on Katsuwonus pelamis viscera

2.2 酶解時間對魚油提取率的影響

圖1表示酶解時間對鰹魚內(nèi)臟魚油提取率的影響。由圖1中可知,鰹魚內(nèi)臟魚油的提取率隨時間增加而提升,但酶解時間大于5.5 h時,魚油提取率增速有明顯的下降,原因可能為隨著時間的增加,堿性蛋白酶與底物充分接觸,作用狀態(tài)基本達到平衡。此外,隨著時間的延長,多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化[23]，魚油顏色也逐漸加深。綜上,選擇最適酶解時間為5.5 h。

圖1 不同酶解時間對魚油提取率的影響Fig.1 Effect of different enzymatic hydrolysis time on extraction rate of fish oil

2.3 酶解溫度對魚油提取率的影響

圖2所示為不同酶解溫度對鰹魚內(nèi)臟魚油提取率的影響。由圖2可知,魚油提取率隨著溫度的上升先增大后減小,這可能是因為蛋白酶生理活性在最適溫度時達到最高,溫度過高或過低酶的活性均會受到影響。在一定范圍內(nèi),酶活性與酶解溫度成正比,體系內(nèi)分子的熱運動加快,酶解效率升高,酶促反應(yīng)也更加完全;一旦超過了其最佳溫度,蛋白酶失去活性,降低酶與底物的反應(yīng)[24]。同時溫度過高會加快魚油的氧化,導(dǎo)致魚油提取率下降,品質(zhì)降低。綜上所述,較適宜的酶解溫度為55 ℃。

圖2 不同酶解溫度對魚油提取率的影響Fig.2 Effects of different enzymatic hydrolysis temperatures on the extraction rate of fish oil

2.4 酶添加量對魚油提取率的影響

酶添加量對鰹魚內(nèi)臟魚油提取率的影響如圖3所示,由圖3可看出,隨著堿性蛋白酶添加量的增加,魚油提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當堿性蛋白酶添加量為2.0%時,鰹魚內(nèi)臟魚油的提取率達到最大值。原因是當酶與底物未達到飽和時,增加酶量可促進蛋白質(zhì)的水解,當達到飽和時,過度酶解導(dǎo)致小分子部分與油脂又發(fā)生乳化,產(chǎn)生絮狀類物質(zhì),使魚油提取率降低。結(jié)果表明,較適宜的酶添加量為2.0%。

圖3 不同酶添加量對魚油提取率的影響Fig.3 Effects of different addtive amout of enzymes on the extraction rate of fish oil

2.5 酶解pH對魚油提取率的影響

酶解pH對鰹魚內(nèi)臟魚油提取率的影響結(jié)果如圖4所示。隨著pH的提升,魚油提取率先增加后下降,當pH達到8.5時,鰹魚內(nèi)臟魚油達到最大值57.30%,這是由于底物和蛋白酶的帶電性都會受到不同酸堿值的影響,同時酸堿值還會影響酶分子的穩(wěn)定性[25],在一定條件下,酶在最適pH時活性最強。鰹魚內(nèi)臟魚油提取率最高時pH為8.5,此時酶的活性最高,酶解效果最好。

圖4 酶解pH對魚油提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH value on fish oil extraction rate

2.6 液固比對魚油提取率的影響

液固比對鰹魚內(nèi)臟魚油提取率的影響如圖5所示。

由圖5可知,當液固比小于1∶1時,酶解的效果與蒸餾水量成正比,隨著水量增加,魚油提取率也隨之提高。此條件下,系統(tǒng)水分的增加有助于蛋白酶更好地作用于底物,提高酶解速度,增加酶解程度,同時脂肪也易于溶出。但是水量一旦超過限度,水分的增加致使底物濃度降低,造成酶解不完全,魚油提取率降低。綜上所述,選擇最佳液固比為1∶1 (g∶g)。

圖5 不同液固比對魚油提取率的影響Fig.5 Effect of different liquid-solid ratios on extraction rate of fish oil

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)表1的設(shè)計進行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗,以鰹魚內(nèi)臟魚油提取率為考察指標,所得實驗結(jié)果見表3，所得回歸方程為:

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

Y=56.20+3.79A-0.78B+1.15C-1.59AB-1.02AC+3.15BC-3.76A2-4.68B2-6.43C2。

由表4可知,模型p值為0.0015,極顯著(p<0.01);失擬項p=0.5832,不顯著(p>0.05),說明該模型為回歸顯著型,相關(guān)系數(shù)為0.9865,說明擬合性高。根據(jù)p值可以看出,三個影響因子對魚油提取率影響的排序:酶添加量>液固比>pH,A、A2、B2、C2的作用極顯著(p<0.01),BC的作用顯著(p<0.05)。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance

基于模擬方差分析,圖6～圖8是根據(jù)軟件對各因素之間的交互作用進行響應(yīng)面分析得到的等高線和三維圖。圖6表示不考慮液固比時,酶添加量和酶解pH交互影響魚油提取率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。由圖6可知,響應(yīng)面的坡度不是很陡,酶添加量和酶解pH交互作用對魚油提取率的影響不顯著;與酶解pH相比,不同水平酶添加量對魚油提取率的影響較大。

圖6 酶添加量和pH的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of enzyme addition amount and pH value

圖8 pH和液固比的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour map of pH and liquid/solid ratio

圖7為不考慮pH影響時,不同水平酶添加量和液固比影響魚油提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖。在酶添加量一定的條件下,魚油提取率隨液固比的增大而提高;當達到一定值時,魚油提取率又會隨液固比的增大而降低。而液固比一定時,魚油提取率隨酶添加量的增加,先增后減。

針對數(shù)字化發(fā)展的趨勢，德國木工機械制造商協(xié)會總經(jīng)理Bernhard Dirr博士表示，德國機械設(shè)備制造業(yè)聯(lián)合會和歐洲木材加工機械制造商聯(lián)合會目前正基于OPC UA（開放式平臺通信統(tǒng)一架構(gòu)），制定相關(guān)標準。這將為現(xiàn)代木材加工注入新動力，現(xiàn)在，該領(lǐng)域諸多細分市場已大范圍實現(xiàn)技術(shù)成熟。即使是規(guī)模較小的工廠，也能全面掌控智能化發(fā)展趨勢，輕松接入國際網(wǎng)絡(luò)，化身具備高度靈活性的小型工廠。

圖7 酶添加量和液固比的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response profile and contour map of enzyme dosage and liquid/solid ratio

由圖8可知,液固比和pH對響應(yīng)曲線影響相對較大,而不同pH對加酶量的響應(yīng)曲線最高值影響比較小。從等高線圖可知,整個圖形呈近橢圓形,兩者之間的交互作用顯著。

2.8 最佳提取條件預(yù)測及驗證

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后,得到最優(yōu)參數(shù)為酶添加量2.13%,pH8.41,液固比1∶1,此時魚油提取率的理論值為57.293%,為了方便實際操作,選取魚油提取率的最佳工藝參數(shù)條件為:加酶量2.0%、pH8.40、液固比1∶1,在此條件下進行三次平行驗證試驗,實際所得魚油提取率的平均值為58.49%±0.45%,接近于理論魚油提取率。因此,響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)可靠性較高。

3 結(jié)論

以鰹魚內(nèi)臟為研究對象,用不同種類蛋白酶對鰹魚內(nèi)臟中魚油進行生物酶法提取,結(jié)果表明,堿性蛋白酶提取魚油的效果最佳,提取率達到57.46%。通過單因素及響應(yīng)面試驗對堿性蛋白酶酶解條件進行優(yōu)化,得出鰹魚內(nèi)臟魚油pH8.40、酶解時間5.5 h、酶解溫度55 ℃、液固比1∶1、酶添加量2.0%的條件下魚油提取率達到最高58.49%±0.45%。蒸煮法結(jié)合低溫-鉀鹽乙醇法提取鰹魚內(nèi)臟魚油的提取率為24%[26],兩者相差35.49%。這表明酶解法的提取率高于蒸煮法結(jié)合低溫-鉀鹽乙醇法,并且酶解法條件溫和,有利于保護魚油的功能性成分。研究結(jié)果為鰹魚加工下腳料的綜合利用提供理論指導(dǎo)。