蜜桔果酒用非釀酒酵母的分離鑒定、 發(fā)酵特性及揮發(fā)性香氣成分分析

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(1.江西師范大學生命科學學院,江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室,江西南昌 330022; 2.江西科技師范大學生命科學學院,江西省生物加工過程重點實驗室,江西南昌 330013; 3.江西博君生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,江西撫州 344700)

對于果酒釀造而言,菌種的選擇決定著果酒的質量。果酒酵母通常分為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)[6]。通常,釀酒酵母有較好的產(chǎn)酒精能力,但產(chǎn)香能力相對較弱;非釀酒酵母產(chǎn)香能力相對較強,能夠生成多種芳香類物質,對果酒風味有積極的影響[7]。因此,選擇優(yōu)良的果酒酵母已不只局限于釀酒酵母,還包括相關環(huán)境中的一些非釀酒酵母。陳清嬋等[8]從柑橘果實上分離得到優(yōu)良的產(chǎn)香酵母JZ-3,該菌株發(fā)酵得到的橘子酒酒體豐滿、香氣濃郁、典型性強,整體品質較高。劇檸等[9]從枸杞果園土壤、鮮果及自然發(fā)酵液中,篩選到適宜枸杞果酒發(fā)酵的葡萄汁有孢漢遜酵母GF-60,與商用釀酒酵母混合發(fā)酵得到的葡萄酒含有更多種類的香氣成分。Lu Y等[10]研究發(fā)現(xiàn),戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)和耐熱克魯維酵母(Kluyveromycesthermotolerans)發(fā)酵的榴蓮酒中高級醇和乙基酯含量更高,酒風味更濃厚,口感更豐富。

目前,蜜桔果酒使用的酵母多為葡萄酒酵母或果酒干酵母,專用酵母菌的研究很少,缺乏適用的酵母菌株,導致蜜桔果酒存在風味不突出、風味欠佳的缺陷,影響了蜜桔果酒的品質及銷量。因此,尋找適合南豐蜜桔果酒的專用酵母菌種是很有必要的。本實驗在南豐蜜桔自然發(fā)酵的過程中分離出非釀酒酵母菌,通過26S rDNA序列分析進行菌種鑒定,并對其發(fā)酵性能及揮發(fā)性香氣成分進行研究,以期篩選出適用蜜桔果酒的非釀酒酵母菌,為進一步混合菌種發(fā)酵改善蜜桔果酒風味提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南豐蜜桔 采摘自江西省南豐縣;高活性干酵母:安琪酵母(果酒專用) 江西博君生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司;培養(yǎng)基:YPD固體(與液體)培養(yǎng)基 滅菌條件為115 ℃,30 min;苯酚、濃硫酸、重鉻酸鉀、硫酸銨 國藥集團化學試劑有限公司。

PHX-280H生化培養(yǎng)箱 寧波萊?？萍加邢薰?HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器有限公司;UV755B可見紫外分光光度計 上海分析儀器總廠;CP114電子天平 美國奧豪斯儀器;TG16-WS臺式高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;PCR儀、凝膠成像儀 伯樂生命醫(yī)學有限公司;XW-80A漩渦混合器 上海馳唐電子有限公司;7000C氣相色譜串聯(lián)質譜聯(lián)用儀 安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離、篩選 將新鮮的蜜桔帶皮榨汁,放入滅菌的三角瓶中于 28 ℃自然發(fā)酵9 d,將發(fā)酵過程中發(fā)酵前期(0～1 d)、發(fā)酵中期(2～4 d)、發(fā)酵后期(5～9 d)的發(fā)酵醪分別稀釋到10-2、10-3、10-4和10-54個稀釋度。每個稀釋度取0.2 mL涂布于YPD培養(yǎng)基上,每個稀釋度設3個重復,在28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。典型的酵母菌菌落表面光滑、濕潤、黏稠,質地柔軟,易挑起,多為乳白或奶油色,有酒香味[11]。根據(jù)此特征選取有典型酵母形態(tài),挑選單菌落于YPD培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)純化,28 ℃培養(yǎng)2 d,4 ℃保藏。

將分離菌株劃線接種于YPD平板上,28 ℃培養(yǎng)3 d,通過嗅聞法[12]初步判斷是否有酯香或醇香,篩選具有較濃酯香氣或特殊果香氣的菌株,進行4 ℃斜面保藏。

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1.2.2 菌株鑒定 采用試劑盒提取的方法(E.Z.N.A. TM Yeast DNA Kit)提取純培養(yǎng)目標菌株的基因組DNA。以引物NL1、NL4擴增其26S rDNA D1/D2基因區(qū)。NL1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′,NL4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。采用40 μL反應體系進行PCR擴增,反應體系為:Premix rTaq 20 μL、NL1 2 μL、NL4 2 μL、DNA 1 μL、dd H2O 15 μL。擴增條件:95 ℃預變性2 min,然后95 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共29次循環(huán),最后72 ℃充分延伸5 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物檢測:取5 μL的 PCR產(chǎn)物,在1.0%瓊脂糖凝膠電泳中分離,電泳儀條件為100 V、30 min。用凝膠成像系統(tǒng)進行分析,將含有目標片段的產(chǎn)物送基因公司測序,測序結果在NCBI上進行BLAST比對。

1.2.3 酵母菌發(fā)酵性能的測定 挑選光滑、糖分含量高、香氣濃、充分成熟、汁液豐富、無霉爛的蜜桔果,剝皮、榨汁、過濾。調(diào)整糖濃度為200 g/L,可滴定酸為1.05 g/L,pH為4.0,加入硫酸銨至終濃度為0.5 g/L。將蜜桔汁分裝于250 mL的三角瓶中,每瓶裝量200 mL,100 ℃滅菌20 min。

在無菌條件下,將產(chǎn)香酵母與商業(yè)釀酒酵母(S.cerevisiae)活化后,以5%的接種量分別接入蜜桔果汁中,裝液量為200 mL(250 mL三角瓶),28 ℃,靜置發(fā)酵10 d。取發(fā)酵的果酒上清液測定乙醇體積分數(shù)、殘?zhí)呛俊⒖偹岷考皃H。

采用分光光度計法[12]測定發(fā)酵液中乙醇體積分數(shù);參考GB/T 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法[13]測定果酒中總糖和滴定酸含量;pH采用pH計法測定。

1.2.4 感官評價 由10位品酒員組成品評小組(包括老師和學生),對蜜桔果酒的色澤、香氣、滋味三個方面進行評價,結果取平均值[14],蜜桔果酒感官評定指標見表1。

表1 蜜桔果酒的感官評分標準Table 1 The scoring for sensory evaluation of tangerine wine

1.2.5 果酒中香氣物質的測定

1.2.5.1 樣品前處理 采用氣相色譜串聯(lián)質譜聯(lián)用儀分析發(fā)酵后蜜桔果酒的香氣成分。取5 mL蜜桔果酒樣品于20 mL頂空瓶中,頂空瓶溫度為80 ℃,保留20 min進行GC-MS分析。

1.2.5.2 GC/MS條件 GC條件:毛細管柱為DB-FFAP(30 m×320 μm×0.25 μm),載氣為高純氦氣,流速1 mL/min,分流進樣,分流比為10∶1。程序升溫:初始溫度40 ℃,保留2 min,以5 ℃/min的速率升至180 ℃,保留2 min,再以8 ℃/min的速率升至230 ℃,保留5 min;檢測器溫度250 ℃。MS條件:四級桿溫度150 ℃;離子源溫度230 ℃;接口溫度180 ℃;電子電離源;電子能量70 eV;質量掃描范圍30～500 amu。

1.2.5.3 定性與定量方法 GC-MS數(shù)據(jù)采集得到的總離子流中各質譜圖運用NIST 14.L標準譜庫檢索,化合物用質譜庫檢索匹配度最高的結果定性,即為MS法;物質定量用峰面積歸一化法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 20.0對不同酵母發(fā)酵的蜜桔果酒各個指標進行顯著性差異分析,應用Origin2016進行作圖,應用Matlab對不同酵母發(fā)酵的蜜桔果酒的揮發(fā)性物質進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離鑒定結果

從蜜桔果酒樣品中共分離到24株酵母菌,其中發(fā)酵前期7株,發(fā)酵中期14株,發(fā)酵后期3株。通過嗅聞法篩選后得到7株酵母菌,對其進行26S rDNA基因序列測定,結果見表2。根據(jù)菌落形態(tài)、顯微形態(tài)特征以及序列對比結果分析,一共鑒定為7種非釀酒酵母,分別為Pichiafermentans(MF979231)、Pichiaaff.fermentans(MF979211)、Pichiakluyveri(MF979216)、Hanseniasporaguilliermondii(MF979212)、Hanseniasporaopuntiae(MF979223)、Hanseniasporathailandica(MF979224)、Candidaethanolica(MF979225)。圖1為7種酵母菌的PCR產(chǎn)物電泳圖,擴增的產(chǎn)物在600～900 bp之間。

表2 酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)序列比對結果Table 2 Blast results of 26S rDNA sequences of the yeast

圖1 酵母菌26S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretograms of 26S rDNA PCR amplificons of yeasts

2.2 酵母菌發(fā)酵能力測定結果

對分離到的酵母菌及商業(yè)釀酒酵母(S.cerevisiae)進行單菌發(fā)酵蜜桔果酒,對發(fā)酵10 d后果酒的殘?zhí)呛亢鸵掖俭w積分數(shù)進行測定,結果如圖2。C.ethanolica和商業(yè)釀酒酵母(S.cerevisiae)能夠將蜜桔汁中的糖幾乎完全消耗,發(fā)酵的蜜桔酒中的殘?zhí)呛糠謩e為1.2、1.3 g/L,H.thailandica和H.guilliermondii發(fā)酵后的蜜桔酒殘?zhí)呛糠謩e為11.8、16.6 g/L,而P.fermentans、P. aff.fermentans、P.kluyveri和H.opuntiae發(fā)酵蜜桔果酒還有20 g/L以上的殘?zhí)恰?/p>

圖2 不同酵母菌對蜜桔果酒殘?zhí)呛?及乙醇體積分數(shù)的影響Fig.2 The effects of yeast species on residual sugar and ethanol in tangerine wine注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

果酒釀造過程中,糖主要為酵母生長提供其所需的能量及發(fā)酵生成酒精,不同酵母菌轉化乙醇的能力不同。圖1中,C.ethanolica和商業(yè)釀酒酵母(S.cerevisiae)能將蜜桔汁中的糖完全利用,部分糖被轉化為酒精,發(fā)酵結束后果酒的乙醇體積分數(shù)分別為8.9%和9.4%。H.thailandica發(fā)酵后的蜜桔酒乙醇體積分數(shù)為6.7%,P. aff.fermentans和H.guilliermondii發(fā)酵后的果酒乙醇體積分數(shù)較低,分別為6.0%和6.3%。

2.3 蜜桔果酒總酸、pH及感官評價

不同酵母菌發(fā)酵蜜桔酒的總酸、pH及感官評價如表3。不同酵母菌發(fā)酵蜜桔酒總酸不同,商業(yè)釀酒酵母(S.cerevisiae)發(fā)酵的蜜桔酒總酸含量為0.88%;H.opuntiae發(fā)酵的果酒總酸含量較高,總酸含量為0.98%;P.aff.fermentans發(fā)酵果酒的總酸含量只有0.69%;其他菌株發(fā)酵的果酒總酸含量在0.75%～0.89%之間,發(fā)酵蜜桔酒的pH在3.55～3.75之間。由感官品評分析得出，H.thailandica的感官品評得分最高,具有較好的口感。

表3 不同酵母菌發(fā)酵蜜桔果酒的總酸、pH、及感官評價Table 3 Total acid,pH,and sensory evaluation of tangerine wine by different yeasts

2.4 蜜桔果酒揮發(fā)性香氣成分分析

由表4可知,8種酵母菌釀得的蜜桔原酒中主要香氣組分共測得41種,主要包括醇類、酯類、酸類、酮類和烴類。其中有酯類物質20種,醇類物質7種,酸類物質4種,酮類物質3種,烴類物質7種。

表4 不同酵母菌發(fā)酵蜜桔酒的揮發(fā)性香氣成分分析Table 4 Analysis of volatile aroma components of fermented tangerine wine by different yeasts

發(fā)酵的蜜桔果酒中醇類物質有2-甲基-1-丁醇、苯乙醇、十一碳烯-4-醇、1-丁炔-3-醇、3-戊醇、叔丁醇、異戊醇。其中苯乙醇是柑橘中主要的醇類物質[2,16],是具有淡雅細膩玫瑰氣味的芳香醇,在很低的濃度下就能產(chǎn)生很高的玫瑰香味,也是葡萄酒重要的呈香物質之一[17]。在發(fā)酵過程中,一些酵母菌能夠通過莽草酸途徑從頭合成或通過氨基酸分解途徑將L-苯丙氨酸轉化為苯乙醇[18]。不同酵母發(fā)酵產(chǎn)生苯乙醇的含量也各不相同,P. aff.fermentans能夠產(chǎn)生較多的苯乙醇。P. aff.fermentans發(fā)酵的蜜桔酒中含有大量的異戊醇,果酒中異戊醇含量過高時,會使果酒風味不正,并且對人體具有一定的毒害作用[19-20]。

酯類物質是果酒的主體香氣成分,多數(shù)酯類物質都具有令人愉快的香氣。在蜜桔酒中檢測到的酯類物質有甲氧基乙酸乙酯、丁二醇二硝酸酯、乙酸乙酯、甲基乙酸酯、3-甲基乙酸丁酯、羊蠟酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、(甲基硫代)甲基亞砜甲酯、硝酸甲酯、丙烯酸乙烯酯、硫酸二丁酯、乙酸苯乙酯、丙酸乙酯、異氰酸甲酯、乙酸異丁酯、乳酸乙酯、(2S)-吡咯烷-2-羧酸乙酯、乙酸正丙酯。商業(yè)釀酒酵母(S.cerevisiae)發(fā)酵的蜜桔酒酯類相對含量較少,總酯相對含量為21.92%,主要的酯類為丁二醇二硝酸酯和乙酸乙酯。P.fermentans和H.thailandica發(fā)酵的蜜桔酒產(chǎn)生較多的酯類物質,總酯相對含量分別為67.15%和60.65%。P.fermentans發(fā)酵的蜜桔酒中主要的酯類物質是乙酸乙酯和3-甲基乙酸丁酯;H.thailandica發(fā)酵的蜜桔酒中酯類物質較豐富,包括乙酸乙酯、3-甲基乙酸丁酯、羊蠟酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、硝酸甲酯、丙烯酸乙烯酯、乙酸苯乙酯、丙酸乙酯、異氰酸甲酯、乳酸乙酯、(2S)-吡咯烷-2-羧酸乙酯和乙酸正丙酯。這些酯類對蜜桔果酒復雜香氣做出了貢獻,能夠減弱尖酸味,協(xié)調(diào)苦澀味,令酒香醇厚。

酸類物質大多是發(fā)酵中的副產(chǎn)物,含量過多會使酒體口感偏酸,風味不足[21]。蜜桔酒中主要的揮發(fā)性酸類是乙酸,P.fermentans和H.guilliermondii發(fā)酵的蜜桔酒中有較高的揮發(fā)性酸。烷烴類化合物相對含量較低且烷烴香味閾值較高,對香氣的直接貢獻不大,但其可能是形成雜環(huán)化合物的重要中間體,有助于提高酒體的整體風味[9]。其中D-檸檬烯是大多數(shù)柑橘和蜜桔果酒中主要的揮發(fā)性成分[2,6],具有令人愉快的檸檬香氣,并且它的藥理活性較強,有顯著的抗菌、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘的作用。

綜合考慮,H.thailandica是一株發(fā)酵蜜桔果酒產(chǎn)香能力較好的菌株,發(fā)酵的蜜桔酒能夠產(chǎn)生豐富的酯類物質,產(chǎn)生較少的雜醇和揮發(fā)性酸,并且具有較好的感官評分。

2.5 不同酵母菌發(fā)酵的蜜桔果酒香氣成分主成分分析

將不同酵母菌發(fā)酵的蜜桔酒通過HS-GC-MS測定的揮發(fā)性物質數(shù)據(jù)導入Matlab軟件中進行PCA處理與分析,得到PCA得分圖和載荷圖(圖3)。從結果可知,PC1、PC2和PC3的貢獻率分別為23.1%、17.4%和14.6%。從圖3A可以看出,不同酵母菌發(fā)酵的蜜桔酒之間區(qū)分度較好,沒有重疊區(qū)域,說明不同酵母菌發(fā)酵蜜桔酒的香氣成分具有顯著差異性。通過PCA分析不僅能發(fā)現(xiàn)樣品之間的異同,更為重要的是能夠發(fā)現(xiàn)造成組間差異的具體變量,這些變量可以為深入研究組間差異,尋找特征指標等提供重要信息。揮發(fā)性香氣成分的主成分分析載荷圖,從圖3B中可以看出,對PCA貢獻較大的質譜信號(m/z),這些特征質譜峰可以有效區(qū)分不同蜜桔酒,這些特征物質包括羊蠟酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸苯乙酯等。由此可見,通過對不同蜜桔果酒香氣成分進行PCA分析,可以有效地了解不同酵母菌發(fā)酵蜜桔酒的差異性物質,為進一步研究提供了技術支持和理論基礎。

圖3 不同酵母菌發(fā)酵蜜桔酒的香氣成分 主成分分析得分圖(A)和載荷圖(B)Fig.3 The score plots(A)and loading plots(B)of principal component analysis for aroma components of fermented tangerine wines by different yeasts注:B圖為物質在PC1和PC2上的載荷圖。

3 討論與結論

目前,蜜桔果酒多為延用葡萄酒酵母或干酵母,缺少專用水果品種和專用果酒釀造酵母,導致蜜桔果酒品質不足。對于果酒釀造而言,菌種的選擇決定著果酒的質量,對果酒的特色形成至關重要。

本實驗從蜜桔果酒樣品中共分離篩選出7株非釀酒酵母,分別為P.fermentans、P.aff.fermentans、P.kluyveri、H.guilliermondii、H.opuntiae、H.thailandica、C.ethanolica。這些非釀酒酵母菌屬為漢遜酵母(Hanseniaspora)、畢赤酵母(Pichia)和假絲酵母(Candida)。Liu等[22]在椪柑酒的發(fā)酵過程中分離到了漢遜酵母、畢赤酵母、假絲酵母和孢圓酵母(Torulaspora)。同樣,漢遜酵母和畢赤酵母也經(jīng)常存在于葡萄及葡萄酒的發(fā)酵過程中[23-24]。

通常,商業(yè)釀酒酵母有較好的產(chǎn)酒精能力,但產(chǎn)香能力相對較弱[7],研究也發(fā)現(xiàn),商業(yè)釀酒酵母(S.cerevisiae)有較好的發(fā)酵性能,但發(fā)酵的蜜桔酒酯類含量較少。本研究分離到的非釀酒酵母中,C.ethanolica有較好的發(fā)酵性能,能夠將蜜桔汁中的糖幾乎完全消耗,發(fā)酵后果酒殘?zhí)菫?.2 g/L,乙醇體積分數(shù)為8.9%,并且較商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵后的蜜桔酒有更豐富的香氣成分和更好的感官評分。Hanseniaspora和Pichia對蜜桔汁中的糖不能完全利用,生成的乙醇量較少。Lee等[25]對發(fā)酵柑橘酒的12株酵母菌的發(fā)酵特性進行了研究,得到2株具有較高酒精含量(10.70%～11.86%),較低殘?zhí)橇?0.64%～1.14%)的酵母菌。Clemente-Jimenez等[23]對葡萄自然發(fā)酵中的酵母菌進行分離鑒定并研究其發(fā)酵特性,其中Candidastellate和S.cerevisiae能將葡萄汁中糖完全利用，轉化為較多的乙醇。

不同酵母菌發(fā)酵蜜桔果酒產(chǎn)生的香氣成分具有顯著差異。通過GC-MS對發(fā)酵的蜜桔果酒揮發(fā)性物質進行檢測,發(fā)現(xiàn)酯類物質是構成蜜桔酒香氣的主要成分。其中,H.thailandica是一株發(fā)酵蜜桔果酒產(chǎn)香能力較好的菌株,能夠產(chǎn)生有較少的雜醇和揮發(fā)性酸和豐富的酯類物質,如乙酸乙酯、羊蠟酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、丙酸乙酯、乳酸乙酯等,能夠減弱尖酸味,協(xié)調(diào)苦澀味,令酒香醇厚,并且具有較好的感官評價。一些研究者從葡萄以及葡萄酒中也分離出一些具有良好的產(chǎn)香性能的酵母菌,用其發(fā)酵的葡萄酒能產(chǎn)生豐富的酯類,更少的脂肪酸等[24,26]。其中乙酸乙酯有果味和甜味,是葡萄酒香氣的重要構成成分[16]。乳酸乙酯和乙酸乙酯一樣具有減弱尖酸味,協(xié)調(diào)苦澀味,令酒香醇厚等作用,它們都是反映果酒風味優(yōu)劣的重要物質[21]。月桂酸乙酯有晚香玉香;乙酸苯乙酯有果香、梔子花香。辛酸乙酯具有玫瑰花香和橙子果香[26]。

本研究通過從蜜桔果酒發(fā)酵過程中分離篩選出的7株非釀酒酵母菌的發(fā)酵性能及產(chǎn)香氣物質研究,得到1株發(fā)酵性能較好的酵母菌C.ethanolica和一株產(chǎn)香能力較好的菌株H.thailandica，為后期混合發(fā)酵蜜桔酒來完成具有更復雜香味的酒精發(fā)酵[25-27,30],進一步改善蜜桔果酒品質提供實驗基礎。