ST2在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的意義①

凌夏君 許 姣 李獻(xiàn)文 周燕娟 莊志方

(常州市武進(jìn)人民醫(yī)院，江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，常州213017)

人類99%的疾病均與機(jī)體免疫有關(guān)。免疫平衡系統(tǒng)是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種生理功能。在高度和諧的生理代謝中，機(jī)體的自穩(wěn)功能能夠及時(shí)準(zhǔn)確地清除體內(nèi)損傷、衰老、變異的細(xì)胞和抗原性物質(zhì)——即抗體復(fù)合物等抗原異物，而對(duì)自身則保持高度的免疫耐受功能。免疫平衡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，只有處在相對(duì)的穩(wěn)定平衡狀態(tài)機(jī)體才是健康的，而免疫的失衡尤其是Th1/Th2的平衡一旦被打破，引起異常的免疫應(yīng)答，機(jī)體將會(huì)出現(xiàn)病理狀態(tài)。本文將進(jìn)一步解釋NSCLC過(guò)程中Th1/Th2失衡現(xiàn)象。

1 資料與方法

1.1材料 2014年1月～2015年10月期間在本院就診經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC的患者45例為研究對(duì)象(肺癌組)。其中男25例，女20例，腺癌25例，鱗癌20例，年齡45～70歲。選擇癌旁正常肺組織標(biāo)本(距離癌組織至少10 cm)作為對(duì)照(正常肺組織組)。

1.2方法

1.2.1HE、IHC檢測(cè)炎癥細(xì)胞及ST2表達(dá) 操作如下：①取材與固定：手術(shù)后取部分新鮮組織標(biāo)本，用 10%福爾馬林固定48 h，進(jìn)行石蠟包埋切片。②HE染色：二甲苯脫臘→乙醇脫水→蘇木精染色→水洗→伊紅染色→二甲苯→中性樹膠封片。③IHC：石蠟包埋的4 μm組織切片→酒精脫水、二甲苯脫蠟→緩沖液中修復(fù)→10%BSA封閉抗原→滴加大鼠抗人ST2單克隆抗體室溫孵育，陰性對(duì)照區(qū)域用PBS→滴加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育→DAB 顯色，樹膠封固，鏡檢(每張切片放大100倍,棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)法：40×10光鏡下,隨機(jī)10個(gè)視野下計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞。 依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分為弱陽(yáng)性(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在25%以下);中等陽(yáng)性(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在25%～49%);強(qiáng)陽(yáng)性(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在50%以上)。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)NSCLC癌組織及正常肺組織中ST2、IL-4、IFN-γ的表達(dá) 2014年1月～2015年10月期間在本院就診經(jīng)病理組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)檢查確診為肺癌的45例患者，手術(shù)后取部分新鮮組織標(biāo)本冷凍于液氮中。Trizol試劑一步法提取總RNA，計(jì)算RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min，然后循環(huán)40次(95℃變性15 s、55℃退火15 s、72℃延伸30 s)，溶解條件:95℃ 15 s、60℃ 15 s、95℃ 15 s。引物的設(shè)計(jì)采用Primer5，目的基因引物及產(chǎn)物大小見表1。

2 結(jié)果

2.1NSCLC癌組織周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及ST2表達(dá) HE染色顯示細(xì)胞大而圓，核為深藍(lán)紫色淋巴細(xì)胞(炎癥細(xì)胞)浸潤(rùn)肺鱗癌、肺腺癌組織，IHC顯示炎性細(xì)胞弱陽(yáng)性表達(dá)ST2，而距離癌組織10 cm以上的正常組織中炎癥細(xì)胞較少，基本不表達(dá)ST2(見圖1、2)。

表1 目的基因引物及產(chǎn)物大小

2.2NSCLC癌組織 ST2 mRNA 的表達(dá) NSCLC癌組織高表達(dá)ST2 mRNA，與正常肺組織相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3，P<0.01)。

2.3NSCLC肺癌組織中IL-4、IFN-γ mRNA的表達(dá) NSCLC肺癌組織中IL-4的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)，IL-4/IFN-γ>1，與正常肺組織組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2，P<0.01)。

圖1 NSCLC癌組織周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(HE，×100)Fig.1 Inflammatory cell infiltration around NSCLC tissue(HE，×100)

圖2 NSCLC癌組織中ST2表達(dá)(IHC，×100)Fig.2 ST2 in tumor tissues of NSCLC(IHC，×100)

圖3 NSCLC患者肺癌組織ST2的表達(dá)Fig.3 ST2 mRNA in tumor tissues of NSCLC

表2 NSCLC肺癌組織中IL-4、IFN-γ的表達(dá)

3 討論

免疫平衡系統(tǒng)是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種動(dòng)態(tài)平衡，只有處在相對(duì)穩(wěn)定的平衡狀態(tài)機(jī)體才是健康的。機(jī)體免疫系統(tǒng)通過(guò)細(xì)胞免疫機(jī)制能識(shí)別并特異地殺傷突變細(xì)胞，在形成腫瘤前清除機(jī)體每天的突變細(xì)胞，即免疫監(jiān)視功能(Immune monitoring function)。然而，部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生了免疫逃逸，發(fā)展為進(jìn)展性腫瘤。天然免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，適應(yīng)性免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等組成的間質(zhì)組織、腫瘤細(xì)胞本身共同組成了腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞通過(guò)直接或間接方式相互作用促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[1，2]。其中機(jī)體免疫系統(tǒng)通過(guò)細(xì)胞免疫機(jī)制能識(shí)別并特異地殺傷突變細(xì)胞，在形成腫瘤前清除機(jī)體每天的突變細(xì)胞，即免疫監(jiān)視功能。然而，部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生了免疫逃逸，發(fā)展為進(jìn)展性腫瘤。因此，只有處在相對(duì)穩(wěn)定免疫平衡狀態(tài)機(jī)體才是健康的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HE染色證明肺鱗癌及腺癌組織中浸潤(rùn)了淋巴細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞，而癌旁正常肺組織較少浸潤(rùn)免疫細(xì)胞。我們用Th1和Th2細(xì)胞分泌的特異因子IFN-γ和IL-4分別代表Th1和Th2細(xì)胞的活化情況。本文RT-PCR結(jié)果提示NSCLC癌旁正常肺組織中IFN-γ相對(duì)表達(dá)量較高，而IL-4表達(dá)相對(duì)較少(IL-4/IFN-γ<1)，即肺癌組織中存在Th1優(yōu)勢(shì)，NSCLC肺癌組織中IL-4表達(dá)量相對(duì)較多(IL-4/IFN-γ>1)，即出現(xiàn)了Th1/Th2偏移現(xiàn)象。Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-12、TNF-β等為主的細(xì)胞因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化和CTLS(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)分化，主要參與細(xì)胞免疫反應(yīng)和吞噬依賴性的保護(hù)反應(yīng)。相反，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，抑制巨噬細(xì)胞的功能，促進(jìn)B細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，參與抗體的大量產(chǎn)生，引起吞噬非依賴性保護(hù)反應(yīng)。Ostrand-Rosenberg S指出特異性免疫和非特異性免疫具有“雙刃劍”作用即抑制或促進(jìn)腫瘤形成。1型CD4+T可輔助CD8+T 抑制腫瘤的形成及發(fā)展，而2型CD4+T通過(guò)B細(xì)胞主導(dǎo)的體液免疫過(guò)程使機(jī)體發(fā)生免疫傾斜，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞(TAMS)即M2巨噬細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)的重要組成，對(duì)腫瘤血管形成及基質(zhì)形成起著重要作用，而M1巨噬細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子或作為抗原提呈細(xì)胞將抗原提呈給CD8+T 發(fā)揮抑制腫瘤的作用[3,4]。Th2 CD4+T細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)TAMS產(chǎn)生促血管形成和促轉(zhuǎn)移因子，促進(jìn)乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，CD4+/CD8+和Th2/Th1高比例預(yù)示著乳腺癌預(yù)后較差[5,6]。ST2又名T1、Fit-1、DER4，為Toll樣-白介素1受體家族(TIRs)成員[7-9]。Yanagisawa等[10]證明ST2基因主要表達(dá)于Th2細(xì)胞[11-13],Le′cart等[14]發(fā)現(xiàn)激活的Th2細(xì)胞表達(dá)可溶性ST2，低表達(dá)ST2L。本實(shí)驗(yàn)證明，與癌旁正常肺癌組織相比，非小細(xì)胞肺癌組織高表達(dá)ST2的同時(shí)也高表達(dá)IL-4，提示癌組織存在Th2型因子的強(qiáng)勢(shì)表達(dá)狀態(tài)。

綜上所述，吸煙、環(huán)境污染等誘因通過(guò)損傷相關(guān)分子模式(DAMP)或者直接激活了Th2反應(yīng)的“開關(guān)”ST2，開啟Th2免疫反應(yīng)參與非小細(xì)胞肺癌形成與發(fā)展過(guò)程。通過(guò)Th2免疫反應(yīng)參與了非小細(xì)胞肺癌形成與發(fā)展過(guò)程，提示如果能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中促使腫瘤細(xì)胞或患者機(jī)體的免疫細(xì)胞由Th2向Th1型逆轉(zhuǎn)，將為腫瘤的免疫治療提供新的方向。ST2有可溶性ST2和模型ST2L兩種形式，其生物作用尚不甚明確，因此，有關(guān)蛋白ST2的作用研究有待進(jìn)一步展開。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)組例數(shù)較少，仍需大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。