哌拉西林鈉對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究①

薛 冰 張家薇 段希斌

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，鄭州450000)

肝臟是人體最大的解毒器官，也是最容易受損的器官之一[1]。缺血、病毒感染、免疫紊亂及外源性物質(zhì)均可造成肝臟損傷[2]。肝病已經(jīng)成為了一個(gè)世界性的健康問(wèn)題。研究表明，藥物濫用是導(dǎo)致肝病的主要原因之一，并且目前尚無(wú)具有明確肝保護(hù)及肝功能提高、肝細(xì)胞再生作用的藥物用于臨床[3]。因此，尋找治療肝病的新的藥物及方法仍是臨床肝病治療亟需解決的問(wèn)題之一。研究表明，氧化自由基和活性氧誘導(dǎo)的氧化損傷及炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的功能紊亂及死亡，是導(dǎo)致肝臟損傷的主要原因[4,5]，提示有效抑制肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)將有利于肝病的治療。哌拉西林鈉(Pipercillin sodium,PS)是臨床常用的半合成青霉素類抗生素，具有抗炎、抗病毒、抗氧化等藥理學(xué)活性。研究表明，PS常被用于治療革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)的敗血癥[6]，還能減輕重癥肺炎患者的臨床癥狀，具有肺保護(hù)作用[7]。但其對(duì)肝損傷的作用及機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用CCl4誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷，并同時(shí)給予PS，以探究PS對(duì)大鼠急性肝損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 40只健康SD雄性大鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK(川)2013-24;PS購(gòu)自北京雙鶴藥業(yè)，生產(chǎn)批號(hào)為120406;丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase,ALT)試劑盒購(gòu)自山東濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司；白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、IL-1β和IL-10試劑盒購(gòu)自南京生物工程研究所；肝組織超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；RIPA裂解液和封閉用山羊血清購(gòu)自北京索萊寶生物科技公司；Bax(sc-65532)、Bcl-2(sc-56015)和Cleaved Caspase-3(sc-271028)一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，實(shí)驗(yàn)所用二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型復(fù)制 將40只健康SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control，Ctrl)、PS組、四氯化碳(CCl4)組和CCl4+PS組。PS組和 CCl4+PS組大鼠每天腹腔注射給予PS，1 g/kg，連續(xù)給藥7 d后，參照文獻(xiàn)方法[3]，對(duì)CCl4組和CCl4+PS組大鼠腹腔注射CCl4溶液(1 ml/kg)。48 h 后處死大鼠，進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2樣品準(zhǔn)備 用10%水合氯醛麻醉大鼠，用注射器于心臟取血，靜置1 h后3 500 r/min 4℃離心15 min，取上層血清儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆?。同時(shí)，快速取下肝臟，并平均分為3份，取其中一份稱重并用生理鹽水洗凈后剝離表面結(jié)締組織，用組織勻漿機(jī)勻漿，15 000 r/min離心5 min，制作成10%的肝勻漿，隨后用低溫離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，取上層上清液存儲(chǔ)于-20℃保存?zhèn)溆?。?%多聚甲醛室溫固定肝組織2 h，制作石蠟切片備用。

1.2.3HE染色 取肝組織石蠟切片，用二甲苯進(jìn)行脫蠟處理后，用濃度梯度的酒精從高到低處理石蠟切片，隨后用蒸餾水沖洗10 min后，將切片放入蘇木精中染色15 min，用自來(lái)水沖洗15 min。隨即采用2%鹽酸乙醇溶液對(duì)切片進(jìn)行分化和漂洗，用乙醇進(jìn)行脫水后加入伊紅乙醇液進(jìn)行復(fù)染，最后再采用高濃度乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明并進(jìn)行封片，于生物顯微鏡下觀察記錄。

1.2.4試劑盒及ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子活性 取冷凍的血清或肝組織勻漿上清液于4℃復(fù)融后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)血清中ALT、AST、IL-6、IL-1β和IL-10的濃度，并檢測(cè)肝組織勻漿上清液中SOD、GSH-Px及MDA的濃度。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取肝組織并用剪刀于冰上將肝組織剪碎成1 mm3大小的組織塊，用RIPA裂解液提取各組大鼠肝組織總蛋白，用BCA試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析后，每組分別取等量蛋白質(zhì)用10%SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行封閉，室溫封閉2 h，隨后加入適宜濃度的一抗(Bcl-2,1∶1 000;Bax,1∶1 000)于4℃封閉過(guò)夜，第二天洗去未結(jié)合一抗，加入二抗室溫孵育1 h。最后滴加化學(xué)發(fā)光顯色液于暗室曝光顯影。并用Image J對(duì)蛋白質(zhì)條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6免疫組化檢測(cè)Caspase-3表達(dá) 取石蠟切片并進(jìn)行脫蠟處理后，用枸櫞酸鹽緩沖液對(duì)切片進(jìn)行高壓抗原修復(fù)，待切片在高壓鍋中冷卻至室溫后，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，加入5%的封閉用正常山羊血清室溫孵育2 h。封閉完成后，滴加Caspase-3一抗，濃度為1∶200，并于4℃封閉過(guò)夜，第二天用磷酸鹽緩沖液清洗切片3次，滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫封閉2 h后，用蘇木精復(fù)染，并滴加DAB顯色液顯色。于生物纖維鏡下觀察Caspase-3的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1PS對(duì)急性肝損傷大鼠肝功能的影響 HE染色結(jié)果表明，Ctrl組和PS組大鼠肝組織細(xì)胞排列整齊，并無(wú)明顯的病理改變(圖1)；CCl4組大鼠肝組織細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮，并伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明CCl4能誘導(dǎo)大鼠肝組織損傷(圖1)；CCl4+PS組大鼠肝組織細(xì)胞排列尚可，核固縮情況與CCl4組比較減輕，偶見(jiàn)少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)，表明PS能改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷。同時(shí)，與Ctrl組比較，CCl4組大鼠血清ALT和AST濃度明顯升高，PS組ALT和AST濃度無(wú)明顯變化(P<0.05，圖2)；與CCl4組比較，CCl4+PS組大鼠血清ALT和AST濃度顯著降低(P<0.05，圖2)，進(jìn)一步表明PS具有肝保護(hù)作用。

2.2PS對(duì)急性肝損傷大鼠炎癥反應(yīng)的影響 與Ctrl組比較，PS組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β和IL-10濃度無(wú)明顯改變，CCl4組大鼠IL-6和IL-1β濃度明顯升高，IL-10濃度明顯降低(P<0.05，圖3)；與CCl4比較，CCl4+PS組大鼠血清IL-6和IL-1β濃度顯著降低，IL-10濃度顯著升高(P<0.05，圖3)，表明PS能抑制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝組織炎癥反應(yīng)。

2.3PS對(duì)急性肝損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCl4組大鼠肝組織SOD和GSH濃度明顯低于Ctrl組，MDA濃度明顯高于Ctrl組(P<0.05，圖4)；CCl4+PS組大鼠肝組織SOD和GSH濃度與CCl4組比較明顯升高，MDA濃度與CCl4比較顯著降低(P<0.05，圖4)，表明PS能抑制CCl4誘導(dǎo)的肝組織氧化應(yīng)激。

2.4PS對(duì)急性肝損傷大鼠細(xì)胞凋亡的影響 與Ctrl組比較，PS組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，CCl4組大鼠肝組織Bcl-2表達(dá)水平明顯降低，Bax表達(dá)水平明顯升高(P<0.01，圖5)，Bcl-2/Bax的比值明顯降低(P<0.001，圖6)；與CCl4組比較，CCl4+PS組Bcl-2表達(dá)水平明顯升高，Bax表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，圖5)，Bcl-2/Bax的比值明顯升高(P<0.001，圖6)，表明PS能抑制CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。此外，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCl4能顯著升高肝組織Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平，PS能顯著減弱CCl4對(duì)Cleaved Caspase-3表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05，圖7)，進(jìn)一步表明PS能抑制CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。

圖1 PS對(duì)大鼠肝組織損傷的作用(×100)Fig.1 Effects of PS on acute liver injury of rats(×100)Note: The HE staining was performed for liver injury.

圖2 PS對(duì)急性肝損傷大鼠血清ALT和AST濃度的影響Fig.2 Effects of PS on concentrations of ALT and AST of acute liver injury ratsNote: *.P<0.05 vs Ctrl group;#.P<0.01 vs CCl4 group.

圖3 PS對(duì)IL-6、IL-1β和IL-10濃度的影響Fig.3 Effects of PS on concentrations of IL-6,IL-1β and IL-10Note: The concentrations of IL-6,IL-1β and IL-10 were determined by ELISA assay.*.P<0.05 vs Ctrl group;#.P<0.01 vs CCl4 group.

圖4 PS對(duì)肝組織SOD、MDA和GSH濃度的影響Fig.4 Effects of PS on levels of SOD,MDA and GSHNote: The levels of SOD,MDA and GSH was measured by kits.*.P<0.05 vs Ctrl group;#.P<0.01 vs CCl4 group.

圖5 PS對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響Fig.5 Effects of PS on expressions of Bcl-2 and BaxNote: The protein levels of Bcl-2 and Bax were measured by Western blot.GAPDH was used as loading control.* *.P<0.01 vs Ctrl group;##.P<0.01 vs CCl4 group.

圖6 PS對(duì)Bcl-2/Bax比值的影響Fig.6 Effects of PS on ratio of Bcl-2/BaxNote: * * *.P<0.01 vs Ctrl group;###.P<0.01 vs CCl4 group.

3 討論

CCl4誘導(dǎo)動(dòng)物肝損傷是最常見(jiàn)的肝損傷動(dòng)物模型的造模方法，因?yàn)槠浒l(fā)病機(jī)制與人類肝病的發(fā)病機(jī)制類似而被廣泛應(yīng)用[8,9]。CCl4誘導(dǎo)肝組織損傷機(jī)制包括自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化及脂質(zhì)過(guò)氧化誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[10]。CCl4進(jìn)入體內(nèi)首先能被肝臟代謝為高活性的三氯甲基自由基，直接誘導(dǎo)肝組織的損傷，同時(shí)三氯甲基自由基還可轉(zhuǎn)化為三氯甲基過(guò)氧化自由基，進(jìn)一步啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化[11,12]。大量氧化自由基的存在可加速細(xì)胞膜過(guò)氧化降解，導(dǎo)致肝細(xì)胞細(xì)胞膜的破壞，使ALT和AST滲漏到細(xì)胞外，從而進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致小葉中心細(xì)胞壞死、氣球樣變性和細(xì)胞浸潤(rùn)[3,13]。因此，在本研究中我們首先采用HE染色判斷CCl4處理后大鼠肝組織的病理?yè)p傷情況，并檢測(cè)血清ALT和AST活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCl4組大鼠肝組織細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞核固縮并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明CCl4可導(dǎo)致大鼠肝損傷。PS對(duì)正常大鼠肝組織無(wú)明顯影響，但能減輕CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型大鼠的肝損傷情況，提示可能對(duì)化學(xué)物質(zhì)引起的肝損傷具有保護(hù)作用。此外，PS還能顯著降低急性肝損傷模型大鼠血清ALT和AST的濃度，進(jìn)一步表明PS具有肝保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是CCl4誘導(dǎo)肝損傷的主要機(jī)制。在肝臟中，CCl4可被細(xì)胞色素P450轉(zhuǎn)化為三氯化碳自由基，進(jìn)而誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死，導(dǎo)致肝功能受損[14]。抑制肝組織氧化應(yīng)激能減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷[15]。研究發(fā)現(xiàn)，PS具有抗氧化應(yīng)激的作用[6]。本研究通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，CCl4能顯著升高大鼠血清脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的濃度，并降低過(guò)氧化物酶SOD和GSH的濃度，PS能顯著減弱CCl4對(duì)MDA的誘導(dǎo)作用及對(duì)SOD和GSH的抑制作用。研究表明，SOD和GSH在對(duì)抗CCl4誘導(dǎo)的肝損傷中發(fā)揮著重要作用[16]。過(guò)氧化物酶和還原性谷胱甘肽是重要的抗氧化酶，能夠減少組織過(guò)氧化物和氧化自由基的產(chǎn)生[17]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要中間產(chǎn)物，與脂質(zhì)過(guò)氧化程度呈正相關(guān)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PS能抑制CCl4誘導(dǎo)的肝組織氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮肝保護(hù)作用。

研究表明，過(guò)度氧化應(yīng)激還可誘導(dǎo)肝組織炎癥反應(yīng)[10]。過(guò)量的活性氧可激活炎癥反應(yīng)相關(guān)通路從而誘導(dǎo)炎癥因子的釋放[18]。同時(shí)，CCl4也能直接誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)細(xì)胞外基制的沉積，加速肝纖維化甚至誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[19]。斛皮黃酮抑制小鼠肝組織炎癥反應(yīng)能顯著減輕CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷[20]。蝴蝶素A也能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)促進(jìn)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟結(jié)構(gòu)及功能的恢復(fù)[10]。本文研究發(fā)現(xiàn)，PS能顯著降低急性肝損傷模型大鼠血清炎癥因子IL-6和IL-1β的濃度，并升高IL-10的濃度，IL-10是一類重要的抑炎因子，表明PS能抑制急性肝損傷大鼠肝組織炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致肝功能損傷的重要機(jī)制。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的死亡，過(guò)量的活性氧可直接作用于線粒體誘導(dǎo)Caspase凋亡信號(hào)通路的啟動(dòng)，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA降解和細(xì)胞凋亡[21]。Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax是線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控蛋白。研究表明，Bax在CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷過(guò)程中表達(dá)增多，可抑制Bcl-2的表達(dá)從而促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C的釋放，誘導(dǎo)Caspase-3表達(dá)，促進(jìn)DNA降解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。本文研究結(jié)果表明，CCl4能顯著降低大鼠肝組織Bcl-2的蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)Bax及Caspase-3的表達(dá)，表明CCl4能誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。PS能顯著升高急性肝損傷大鼠肝組織Bcl-2的表達(dá)水平，抑制Bax和Caspase-3的表達(dá)，表明PS能抑制CCl4誘導(dǎo)的線粒體細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PS能減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷，降低肝組織ALT和AST的濃度；同時(shí)還能降低肝組織MDA活性，促進(jìn)SOD和GSH的分泌，抑制促炎癥因子IL-6和IL-1β的活性，升高血清抑炎因子IL-10濃度。此外，PS還能促進(jìn)急性肝損傷大鼠肝組織Bcl-2的表達(dá)，抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)，提示PS能通過(guò)增強(qiáng)肝臟功能、抑制細(xì)胞凋亡對(duì)抗CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷，作用機(jī)制與抑制肝組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

本研究首次探究了PS對(duì)急性肝損傷的作用，并發(fā)現(xiàn)PS具有潛在的肝保護(hù)活性，可能為PS與其他藥物聯(lián)合用藥從而降低藥物的肝毒性作用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。