根皮素調(diào)控NF-κB對MRL/lpr狼瘡性腎炎小鼠的保護作用①

胡義陽 余鵬程

(泉州市第一醫(yī)院,泉州362000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)，也稱為狼瘡，是一種自身免疫性疾病的特征，是自身抗體產(chǎn)生，免疫復(fù)合物沉積，白細胞浸潤，補體激活和炎癥細胞介導(dǎo)的組織損傷。狼瘡性腎炎(Lupus nephritis,LN)，也稱為SLE腎炎，是腎臟的炎癥由SLE引起的。 LN是SLE最嚴重的并發(fā)癥之一，并且是SLE患者發(fā)病率和死亡率的主要原因。雖然免疫治療改善SLE腎病患者的預(yù)后疾病，最終LN患者的比例很大進展為終末期腎病[1]。目前研究認為，免疫調(diào)節(jié)失衡與炎癥等關(guān)鍵致病環(huán)節(jié)是狼瘡性腎炎的主要特征，同時也是狼瘡性腎炎的重要發(fā)病機制[2]。因此，探尋新的治療手段來調(diào)節(jié)免疫功能以及控制炎癥反應(yīng)可能為治療狼瘡性腎炎損傷提供新思路。

根皮素是一種天然化合物，廣泛存在于蘋果樹的樹皮、葉子和果實中[3]。根皮素有許多生物活性，其中抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用最為突出[4]。有研究顯示，根皮素能夠顯著抑制炎癥基因的表達[5]。Chang等[6]在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激的巨噬細胞中觀察到，根皮素預(yù)處理能夠顯著抑制NF-κB的活化。既往研究證實，NF-κB的活化以及下游TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生能夠顯著促進狼瘡性腎炎的發(fā)展[2]。然而，根皮素是否通過調(diào)控NF-κB通路在狼瘡性腎炎中發(fā)揮保護功能尚未闡明。因此，本研究建立小鼠狼瘡性腎炎模型，擬觀察根皮素對狼瘡性腎炎的影響及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 P-IκB、NF-κB、Fibrillirin、F4/80、CCL2、NALP3、Caspase-1p20、GAPDH抗體購自Cell signaling technology 公司。根皮素購自上海融禾(純度≥99%，批號：161229)。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司(Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.,China)。HE染色試劑盒由北京海德創(chuàng)業(yè)公司提供。IL-1β、TNF-α檢測試劑盒購自上海藍基生物公司。

1.2方法

1.2.1動物及實驗分組 10周齡 C57BL/6 雌性小鼠，15只，體質(zhì)量(27.0±1.6)g。純種10周 MRL/lpr 雌性小鼠，30只，體質(zhì)量(27.0±1.5)g。2 種小鼠均由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供，合格證號 SCXK( 蘇) 2017-0008。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(23±1)℃，濕度(55±5)%，12 h 循環(huán)光照，給予清潔級無菌墊料、飼料和飲水，讓其自由攝食、飲水。實驗規(guī)范嚴格按照實驗動物規(guī)范條例進行。分為對照組：C57BL/6 雌性小鼠，15只，給予同等劑量0.5% CMC-Na；模型組： MRL/lpr 雌性小鼠，15只，給予同等劑量0.5% CMC-Na；治療組：MRL/lpr 雌性小鼠，15只，根皮素(400 mg/kg，溶于0.5% CMC-Na溶液)灌胃處理8周[7]。

1.2.2尿蛋白檢測 將所有尿液標(biāo)本用雙蒸水稀釋10 倍后使用，用BCA法檢測樣本中蛋白含量。使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒進行，按說明書操作，加入樣本和標(biāo)準品后，加入BCA 200 μl工作液，37℃孵育30 min。酶標(biāo)儀(波長562 nm)測定吸光度A。根據(jù)標(biāo)準品計算樣品的蛋白濃度。

1.2.3免疫熒光檢測各組腎臟IgG沉積情況 腎組織冰凍切片PBS漂洗3次，每次5 min;滴加Alexa Fluor-546標(biāo)記的IgG抗體，室溫避光孵育2 h。PBS漂洗后，避光條件下甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0 軟件進行熒光強度分析。

1.2.4腎臟組織病理形態(tài)學(xué) 觀察取肺組織，常規(guī)沖洗后多聚甲醛固定，石蠟包埋切片并經(jīng)HE染色法顯微鏡下觀察各組腎臟的炎癥浸潤情況。

1.2.5ELISA驗證實驗檢測 小鼠腎臟組織以及血清中抗ds-DNA、IL-1β、TNF-α的含量，3組的小鼠腎臟組織，浸泡于預(yù)冷的PBS緩沖液中，研磨后制成勻漿液，離心后取上清。按相應(yīng)試劑盒說明書操作，配置梯度標(biāo)準品與檢測試劑，每孔加入的樣品/對照品100 μl，每個樣品重復(fù)2次，4℃孵育過夜，洗板后加入檢測抗體100 μl，室溫孵育1 h，洗板后加入HRP-Streptavidin工作液，室溫45 min，洗板后加入TMB顯色液，室溫30 min;洗板后每孔加入終止液 50 μl，在450 nm波長處讀數(shù)A，繪制標(biāo)準曲線，計算出樣品濃度，每個樣品重復(fù)的 2 孔取均值用于數(shù)據(jù)分析。血清樣本離心后，方法同上。

1.2.6Western blot 檢測 小鼠腎臟組織P-IκB、NF-κB、F4/80、CCL2、NALP3、Caspase-1p20、蛋白表達將提取后的蛋白進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、一抗4℃過夜孵育，用洗膜液漂洗后，二抗雜交1 h，清洗后加上化學(xué)發(fā)光劑(ECL)顯色，上機檢測。

2 結(jié)果

2.1小鼠尿蛋白含量 每2周分別留取模型組以及治療組小鼠的尿液，檢測尿蛋白的含量。模型組小鼠尿蛋白含量呈時間依賴性升高，而治療組中給予根皮素后16、18周的尿蛋白含量較模型組顯著降低(表1，P<0.05)。

2.2腎臟組織病理學(xué)觀察 較對照組相比，HE染色下模型組小鼠腎小球增生，腎小球硬化以及腎小球周圍炎癥明顯加重，而給予根皮素治療后治療組腎臟病理改變明顯緩解(圖1)。

2.3腎組織IgG沉積觀察 較對照組相比，模型組小鼠腎小球大量IgG免疫復(fù)合物沉積，熒光強度明顯增加，而給予根皮素治療后治療組腎小球免疫復(fù)合物沉積情況緩解(圖2，P<0.05)。

2.4各組小鼠血清抗ds-DNA、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)水平比較 模型組小鼠血清抗ds-DNA、BUN、CRE水平較對照組明顯增加(P<0.05)，而給予根皮素治療后血清抗ds-DNA、 BUN、CRE增加水平明顯得到緩解，說明根皮素減輕了腎損傷(圖3，P<0.05)。

表1 兩組小鼠各時間點尿蛋白檢測

Note：Compared with model group，1)P<0.05.

圖1 腎組織HE染色Fig.1 HE staining

圖2 腎組織IgG熒光染色Fig.2 IgG fluorescent staining in renal tissueNote: Compared with control group，*.P<0.05；compared with model group，#.P<0.05.

圖3 各組小鼠血清抗ds-DNA，BUN，CRE水平比較Fig.3 Comparison of serum anti-ds-DNA,BUN and CRE levels in different groups of miceNote: Compared with control group，*.P<0.05；compared with model group，#.P<0.05.

2.5根皮素對狼瘡腎NF-κB激活影響 NF-κB活化與SLE的發(fā)病機制有關(guān)[8]。模型組中NF-κB活化顯著增強，表現(xiàn)為胞溶質(zhì)蛋白中IκB的磷酸化與對照組相比顯著增加，同時NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位也較對照組小鼠相比顯著增加(圖4，P<0.05)。而給予根皮素干預(yù)后IκB的磷酸化以及NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位明顯受到了抑制(圖4，P<0.05)。

圖4 腎組織中NF-κB的激活情況Fig.4 Activation of NF-κB in renal tissuesNote: Compared with control group，*.P<0.05；compared with model group，#.P<0.05.

圖5 腎組織中F4/80，CCL2，NALP3和Caspase-1p20蛋白表達情況Fig.5 Expression of F4/80,CCL2,NALP3 and Caspase-1p20 proteins in renal tissuesNote: Compared with control group，*.P<0.05；compared with model group，#.P<0.05.

圖6 腎組織以及血清中TNF-α和IL-1β的水平Fig.6 Renal tissue and serum levels of TNF-α and IL-1Note: Compared with control group，*.P<0.05；compared with model group，#.P<0.05.

2.6根皮素對狼瘡腎炎癥的影響 免疫組化結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組中巨噬細胞標(biāo)記物F4/80表達明顯增加，提示模型組中巨噬細胞浸潤增加，而根皮素治療能明顯改善巨噬細胞的浸潤(圖5A，P<0.05)。此外，Western blot結(jié)果顯示，模型組中F4/80、炎癥趨化因子CCL2、炎癥小體NALP3和Caspase-1p20蛋白表達明顯增加(圖5B，P<0.05)，而給予根皮素干預(yù)后F4/80、CCL2、NALP3和Caspase-1p20蛋白的增加水平明顯降低(圖5B，P<0.05)，提示根皮素抑制了狼瘡腎組織的炎癥反應(yīng)。

2.7根皮素對腎組織以及血清中TNF-α和IL-1β的影響 TNF-α和IL-1β作為NF-κB及NALP3的下游，因此我們檢測了TNF-α和IL-1β在血清以及腎組織中的水平，與對照組相比，模型組腎組織以及血清中TNF-α和IL-1β顯著增高(圖6，P<0.05)，而給予根皮素干預(yù)后TNF-α和IL-1β在腎組織以及血清中的水平明顯降低(圖6，P<0.05)。

3 討論

LN是導(dǎo)致SLE患者病情惡化的主要原因。目前針對LN的新藥物尚不能滿足臨床需求[9]。在本研究中，我們證明根皮素治療可以改善MRL/lpr小鼠中LN的嚴重程度。 經(jīng)過根皮素治療后的MRL/lpr的小鼠其腎損傷明顯得到了緩解。表現(xiàn)為尿蛋白評分，血清尿素氮和肌酸酐水平顯著降低。同時經(jīng)過根皮素干預(yù)后的MRL/lpr小鼠，其血清抗dsDNA抗體減少，減輕了免疫復(fù)合物在腎小球的沉積。進一步探討根皮素作用機制發(fā)現(xiàn)，根皮素能夠顯著抑制NF-κB的活化和NLRP3炎性體激活，減少了下游炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生與釋放。根皮素治療也顯著降低CCL2的表達和巨噬細胞浸潤。NF-κB與包括LN在內(nèi)的幾種自身免疫性疾病的發(fā)病機制有關(guān)[10]。多項研究表明，NF-κB的激活能夠加重LN患者腎小球的破壞以及伴隨大量炎癥因子的產(chǎn)生。 NF-κB的激活需要IKKβ活性使IκB磷酸化。抑制IKKβ能夠減輕缺氧誘導(dǎo)大鼠腎小管的損傷[11]。 IKK選擇性抑制劑Bay11-7082能夠通過抑制NF-κB活化改善狼瘡腎炎小鼠的腎損傷[9]。 A20負面調(diào)節(jié)NF-κB活化和泛素結(jié)合蛋白ABIN1，通過促進A20的作用和抑制NF-κB信號傳導(dǎo)[12]。表達無活性形式的ABIN1的敲入小鼠能夠激活NF-κB并促進狼瘡性腎炎的發(fā)展[13]。因此，NF-κB信號通路能夠作為LN治療的潛在靶點。我們的數(shù)據(jù)顯示根皮素能夠顯著抑制NF-κB活性，抑制炎性細胞因子TNF-α，IL-1β的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明根皮素可抑制NF-κB的活化從而達到對LN的保護作用。

同時，NLRP3炎癥小體也被多項研究證明參與了LN的發(fā)生發(fā)展，并在LN中發(fā)揮了重要作用[14]。 抑制NF-κB也能夠抑制NLRP3表達，減少IL-1β和IL-18在腎臟中的分泌，從而保護MRL/lpr小鼠腎功能。在除了NLRP3之外，caspase-1也在小鼠LN中發(fā)揮了重要性。 有研究表明，caspase-1缺陷型小鼠能夠減緩LN的發(fā)生發(fā)展。通過抑制P2X7受體，從而抑制NLRP3和capase-1的激活，達到保護LN的目的[15]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)根皮素治療后顯著抑制NLRP3和caspase-1活化，影響了白介素1β的成熟。因此，根皮素能夠抑制炎性體的激活，從而在LN中發(fā)揮保護作用。有研究認為腎巨噬細胞作為LN疾病的標(biāo)志物，巨噬細胞的浸潤與LN發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。CCL2(MCP-1)是單核細胞有效的趨化因子。MCP-1、CCR2的受體能夠使單核細胞迅速聚集于炎癥部位。抑制MCP-1/CCR2信號傳導(dǎo)也能夠減輕炎性巨噬細胞對LN腎組織的破壞。本實驗中證明根皮素治療可抑制CCL2的表達，從而抑制巨噬細胞浸潤，達到保護LN的目的。

綜上所述，根皮素可以通過抑制NALP3，NF-κB的激活，從而抑制炎癥細胞的浸潤，炎癥因子的產(chǎn)生，減輕LN的腎損害，改善小鼠預(yù)后。本實驗通過多個途徑研究根皮素對LN小鼠的影響，為目前LN治療提供了新的思路，并揭示潛在的分子機制，為根皮素的臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。