BS69在結(jié)直腸癌組織中的表達以及病理相關性研究①

謝亞鋒 匡小霞 許志杰 丁雅婷 閆圣玉 張 僑 劉菀瑩

(南華大學附屬第二醫(yī)院肛腸科，衡陽421001)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是在全球范圍內(nèi)最常見的消化道腫瘤，其惡性程度高，在男性癌癥發(fā)病率中居第三位，而在女性癌癥發(fā)病率中居第二位。不僅如此，隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，居民飲食結(jié)構(gòu)以及生活方式的改變，40歲以下的結(jié)直腸癌患者越來越多[1，2]。早期結(jié)直腸癌癥狀不明顯，容易被患者忽視，而就診時往往伴有多器官被侵犯、有遠處轉(zhuǎn)移等情況發(fā)生。因此對患者而言，治療的難度、費用以及預后等都是沉重的負擔[3]。目前對結(jié)直腸癌的研究已有一定的認識，其病情的發(fā)展是多個步驟序慣性的，不只是某個特定基因突變，而是各個階段不同基因改變的過程?，F(xiàn)階段對結(jié)直腸癌以手術治療為主，但多數(shù)腫瘤被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是晚期，且在手術后容易復發(fā)，其他輔助治療效果不明顯，影響到患者的生存。所以對結(jié)直腸癌的發(fā)生機制要進一步研究，以便搜索更加有效地治療方式。

BS69是一種新近被確認的細胞蛋白，研究發(fā)現(xiàn)這種蛋白既能與細胞蛋白如EMSY、c-Myb等[4]又可以與病毒蛋白[5]相互作用發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。但迄今為止，對BS69在腫瘤方面的研究主要是在乳腺癌和惡性血液病方面，在結(jié)直腸癌方面報道很少，本研究探討結(jié)直腸癌細胞系和患者組織中BS69蛋白和mRNA的表達情況，并分析與患者病理特征之間的關系，為結(jié)直腸癌的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選擇2016年8月至2017年10月間我院手術切除、術后經(jīng)病理診斷為結(jié)直腸癌的組織標本60例，另取遠離癌組織(離腫瘤邊緣10 cm)的25例正常組織作為對照，標本提取后立即置于4%多聚甲醛中固定保存。在所有患者中，男性35例，女性25例；年齡≤65歲者44 例，>65歲者16例；局部淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移者33例，轉(zhuǎn)移者27例；腫瘤直徑≤5 cm者27例，>5 cm者33例；按Dukes分期標準進行分期，其中A期 18例，B 期15例，C 期 14例，D 期13例；遠處轉(zhuǎn)移者13例，無遠處轉(zhuǎn)移者47例；直腸癌28例，結(jié)腸癌32例；臨床分級：Ⅰ級 19例，Ⅱ級21例，Ⅲ級20例；所有結(jié)直腸癌病例術前均未接受放化療或免疫治療。

1.1.2試劑與儀器 兔抗人BS69多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體、生物素標記的羊抗兔抗體(Thermo公司)；SV0002-12兩步法免疫組化檢測試劑盒、DAB 顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL顯色試劑盒(Thermo公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2方法

1.2.1免疫組化法檢查BS69在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達 采用免疫組化SP法,取手術切除的結(jié)直腸癌組織標本，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm 厚切片。切片常規(guī)脫蠟、水化，置于 pH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中微波加熱修復，H2O2封閉，滴加適量稀釋的鼠抗人 BS69多克隆抗體，抗體稀釋濃度分別按1∶400，37℃ 2 h，PBS 沖洗8 min×3次，加入二抗(1∶200)，37℃孵育1 h，PBS沖洗8 min×3次，DAB 顯色37℃ 20 min，蘇木素復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。以 PBS 代替一抗作陰性對照，以已知陽性反應切片作為陽性對照。參照文獻[6]對BS69陽性表達進行判定。BS69陽性染色主要定位于細胞核，細胞漿有少量存在，呈棕黃色或棕褐色顆粒;每張切片隨機取5 個高倍鏡視野，由兩名具有多年經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)師雙盲計數(shù)，計算陽性細胞所占比例(陽性表達率)，≥10%為陽性反應，<10%為陰性反應。以0～3分對陽性表達率進行評分，當陽性表達率≤10%計0分，10%<陽性表達率≤50%計1分，50%<陽性表達率≤ 75%計2分，陽性表達率>75%計3分；染色強度為0～3分，未著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；最終的評分為兩個指標的乘積。其中3分以上為高表達。

1.2.2Western blot檢測 采用RIPA裂解液提取結(jié)直腸癌細胞系W480、HCT116 和 DLD1 及正常結(jié)直腸上皮細胞系 FHC的總蛋白。經(jīng)BCA法蛋白定量后上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)：制備 5%濃縮膠及 12%的分離膠。電泳：調(diào)解電壓至80 V、90 min后轉(zhuǎn)為100 V待溴酚藍跑至距分離膠底部0.5 cm時停止。轉(zhuǎn)膜：280 mA恒流1 h，結(jié)束后關閉電源取出PVDF膜，在麗春紅染液中浸泡10 min，如有條帶顯現(xiàn)說明轉(zhuǎn)膜成功，采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1.5 h。加一抗：用TBS稀釋BS69(1∶200)、β-actin(1∶2 000)，4℃冰箱過夜。加二抗37℃ 2 h，結(jié)束后用TBST漂洗10 min×3次，后顯影。用 Quantity One軟件對蛋白質(zhì)條帶進行分析，測定其吸光度值。BS69蛋白的相對表達強度=BS69蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值。

1.2.3RT-qPCR 法檢測BS69的mRNA水平 按照Trizol試劑盒說明書分別提取癌及癌旁組織的總RNA，并測定濃度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄 cDNA合成，反應條件如下:預變性95℃ 5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸 30 s，循環(huán) 40 次。實時熒光使用 ABI PRISM 7500 Sequence Detector 檢測。引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司設計并合成，BS69上游引物序列:5′-AGTCTG-GCCCACGGACCAT-3′，下游引物:′-CCAGTTTGT-CTCTCCCTG-3′。以GAPDH蛋白為內(nèi)參，上游引物:5′-GGATCCCTCCAGAGCGAAAAT-3′，下游引物:5′-GTCATACTTCTGCTGTTGCATGG-3′。用系統(tǒng)軟件進行結(jié)果分析：樣品的相對表達用2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=結(jié)直腸癌ΔCt-正常結(jié)直腸黏膜組織ΔCt。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中BS69的表達 采用免疫組化法對60例結(jié)直腸癌和25例癌旁正常組織中BS69 進行檢測，結(jié)果顯示BS69主要在細胞核上表達呈棕褐色、棕黃色顆粒。BS69在癌組織和正常組織中的陽性表達率分別為65%(39/60)和88%(22/25)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過免疫組化圖可以觀察出，BS69在多數(shù)癌旁正常組織中陽性細胞數(shù)較多，顏色較深，而陽性細胞在結(jié)腸癌組織中較少，顏色較淺，詳見表1、圖1。

2.2結(jié)直腸癌組織中BS69的表達與臨床病理學特征之間的相關性 BS69在結(jié)直腸癌組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤分級、Dukes 分期呈負相關(P<0.05)，而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位均無明顯相關性(P>0.05)。在組織分級中，BS69在Ⅰ、Ⅱ級中的陽性蛋白表達率要高于Ⅲ級中的表達(P=0.015)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者與有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比BS69蛋白陽性率明顯上升(P=0.007)，而有遠處轉(zhuǎn)移者與無遠處轉(zhuǎn)移者相比蛋白陽性率明顯降低(P=0.038)，Dukes 分期 A/B 期中的BS69陽性蛋白表達率與C/D 期相比明顯上升(P=0.007)，詳見表2。

表1 BS69在結(jié)直腸癌和正常組織中表達差異

圖1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中BS69的表達Fig.1 Immunohistochemical detection of BS69 expression in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissuesNote: A.Normal colorectal tissues;B.Highly differentiated colorectal cancer tissues;C.Middle differentiated colorectal cancer tissues;D.Poorly differentiated colorectal cancer tissues.

2.3Western blot檢測BS69蛋白在各細胞系中的表達 Western blot檢測結(jié)果顯示，BS69在FHC、DLD-1、SW480、HCT116細胞系中相對表達強度分別為 0.28±0.05、0.10±0.02、0.77±0.10、0.08±0.01，其中SW480細胞系中BS69蛋白表達最高，而 HCT116細胞系中BS69蛋白表達水平最低，且低于FHC中蛋白表達，詳見圖2。

2.4BS69 mRNA的表達情況 統(tǒng)計60例結(jié)直腸癌與25例癌旁正常組織的RT-qPCR數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織的 2-ΔΔCt均值為0.357±0.175，癌旁正常對照組織的2-ΔΔCt均值為1.000±0.224。結(jié)果相比于癌旁正常組織，癌組織中BS69的mRNA水平相對較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 結(jié)直腸癌組織中BS69的表達與臨床病理學特征之間的相關性

圖2 Western blot檢測BS69蛋白在各細胞系中的表達Fig.2 Western blot to detect the expression of BS69 protein in various cell linesNote: 1.FHC;2.DLD-1;3.SW480;4.HCT116.

3 討論

結(jié)直腸癌是在各種腫瘤致病因素作用下，腸道黏膜上皮細胞發(fā)生基因改變導致其無法對生長進行調(diào)控，細胞周期發(fā)生紊亂、惡性增生而形成的一種消化道惡性腫瘤。文獻報道[7]結(jié)直腸癌的發(fā)生率已居于癌癥前三位，并可能在短時間內(nèi)上升至第一，從臨床醫(yī)學角度看，對結(jié)直腸癌進行手術治療以及放化療等都可以獲得有效治療，但研究顯示癌癥患者死亡的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移，而結(jié)直腸癌最主要轉(zhuǎn)移部位是肝臟，初診時肝轉(zhuǎn)移病灶僅10%～20%能夠被徹底清除，絕大多數(shù)仍累及大血管，導致患者預后恢復差，中位生存期僅1年[8，9]。結(jié)直腸癌的發(fā)病機制與信號傳導通路中的有關分子異?；罨?、表達有關，其發(fā)病是一個多基因、多步驟、多因素的復雜過程。

Hateboer等[10]首次發(fā)現(xiàn)的BS69 是一種腺病毒E1A 結(jié)合蛋白，這種蛋白能與E1A特異性結(jié)合，還可以抑制COS-7細胞中E1A的反式激活作用。Hateboer等[10]還用Northern雜交的方法，研究小鼠不同組織中BS69表達情況，并在所有被檢測組織中發(fā)現(xiàn)一個轉(zhuǎn)錄本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腦、肺、睪丸中表達水平較低，而在腎臟中的表達量最高。同時作為一種腺病毒結(jié)合蛋白，BS69通過289R EIA腫瘤蛋白抑制反式激活，在與各種轉(zhuǎn)錄因子的聯(lián)系中起到協(xié)同抑制作用，對EIA的轉(zhuǎn)錄及反式活化起到抑制效果。但到目前為止，BS69依舊有很多生物學功能及特點仍未研究透徹。除此之外，BS69 還可能在細胞衰老過程中起到作用[11]。例如在人的原代成纖維細胞 IMR90中，使用RNA對BS69進行干擾能使其表達水平下降，原代成纖維細胞擴增速度變得非常緩慢，這說明 BS69 對細胞周期的調(diào)控有一定作用[12]；與此用時，研究者還發(fā)現(xiàn) BS69作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控的抑制因子，在各種組織細胞中廣泛表達。BS69在病毒、細胞中與蛋白相互作用，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制功能。同時對組蛋白H3.3K36me3甲基化修飾特異性識別，對RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起到延長作用，因此BS69被認為是轉(zhuǎn)錄抑制因子和潛在的腫瘤抑制因子，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

在本次研究中采用免疫組化法檢測結(jié)直腸癌及正常組織中BS69蛋白的陽性表達率，結(jié)果分別為88%(22/25)和65%(39/60)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這說明在結(jié)直腸癌組織中BS69的基因編碼可能發(fā)生變異，下調(diào)其蛋白表達水平。但實驗中發(fā)現(xiàn)少數(shù)癌組織中BS69表達呈強陽性，同時結(jié)直腸癌系細胞的Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)SW480細胞系中BS69蛋白表達最高，這和少數(shù)結(jié)直腸癌組織中BS69的強陽性結(jié)果基本一致。本實驗還采用RT-qPCR法檢測BS69在癌組織和正常組織中的mRNA的表達水平，結(jié)果與免疫組化蛋白陽性率趨勢基本一致，在結(jié)直腸癌組織中BS69 mRNA的表達水平與癌旁正常組織相比顯著下降，說明BS69可能在基因的轉(zhuǎn)錄階段已經(jīng)出現(xiàn)缺失。結(jié)直腸癌細胞系Western blot檢測結(jié)果顯示，BS69在SW480細胞系中表達最高，而 HCT116細胞系中表達水平最低，且低于FHC中蛋白表達，這些提示BS69并不是在所有結(jié)直腸癌中低表達，這可能與不同細胞系的惡性程度有關。在BS69與臨床病理學特征的相關性研究中，BS69 的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤分級、Dukes 分期呈負相關(P<0.05)，而與患者的腫瘤直徑、腫瘤部位、性別、年齡均無明顯關系(P>0.05)，表明 BS69 低表達參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，BS69 在正常組織中高表達、結(jié)直腸癌組織中低表達，因此可以被認為是一種潛在的轉(zhuǎn)錄抑制因子和腫瘤抑制因子，但在部分結(jié)直腸癌中出現(xiàn)異常高表達，說明可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，檢測癌組織中BS69表達有助于對結(jié)直腸癌惡性程度、轉(zhuǎn)移和預后展開進一步研究和判斷。