心肌缺血再灌注損傷對mir-499水平表達及免疫學的影響①

楊 偉 王燕瓊 李媛華 邵建林 白向峰

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，昆明620032)

急性心肌梗死(Acute myocardiol infarction，AMI)是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血、缺氧引起的心肌壞死，臨床表現(xiàn)為劇烈、持久的胸骨后疼痛，且患者休息并給予硝酸甘油類藥物難以完全緩解，部分患者可伴有心肌酶活性增高及進行性心電圖變化，嚴重者將會引起心律失常、休克或心力衰竭[1]。溶栓和經(jīng)皮冠脈介入是治療AMI主要方法，能降低患者病死率。但是，其所致的再灌注損傷影響預后，且患者治療后心力衰竭發(fā)病率在45%以上。缺血再灌注損傷則是指機體遭受一段時間缺血的組織恢復灌注后，缺血組織損傷程度不但沒有減輕反而急速加劇，常見誘因包括：血管內皮功能障礙、心肌細胞凋亡、收縮功能障礙及再灌注心律失常等，影響患者心臟功能[2]。

microRNA是一類由20～25個核苷酸構成的高度保守的內源性單鏈非編碼RNA，在高等生命中發(fā)揮了重要作用，能直接參與生物細胞的增殖、分化、凋亡、免疫等[3，4]。通過前期基因預測軟件分析看出：mir-499可能參與心肌缺血再灌注損傷發(fā)生、發(fā)展。mir-499具有心肌細胞特異性，僅在心肌細胞表達，在心肌肥厚、心力衰竭、心臟電生理傳導中發(fā)揮重要的作用。國外學者實驗結果表明[5]：在心肌缺血再灌注損傷中，再灌注24 h內可在梗死周邊檢測到T細胞，且在隨后的3～7 d持續(xù)性增加。由此看出：T淋巴細胞能在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，但是與microRNA的關系缺乏研究。因此，本課題以2016年12月～2018年2月在我院進行實驗的SD大鼠60只為研究對象，探討心肌缺血再灌注損傷對mir-499水平表達及免疫學的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 選擇2016年12月～2018年2月在我院進行實驗的SD大鼠60只，隨機選取大鼠20只設為空白對照組。剩余40只SD大鼠建立心肌缺血再灌注損傷模型，建模成功后隨機分為缺血后處理組(n=20)和心肌缺血再灌注損傷組(n=20)。60只SD大鼠，雄性，清潔級，體質量220～270 g，平均(190.35±0.83)g，所選動物均由醫(yī)學動物實驗中心提供。SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食，試驗均通過醫(yī)院動物委員會批準同意。

1.1.2主要儀器和試劑 研究所需儀器與試劑包括：DAB Kit酶底物顯色試劑盒、白洋 G16 型臺式高速離心肌、中性樹膠、石蠟切片機(LEICA-RM2235型)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH.BII 型)、光學顯微鏡及Msho數(shù)字成像系統(tǒng)、mRNA逆轉錄試劑盒、引物設計合成、PVDF膜及PCR等，其廠家見表1。

1.2方法

1.2.1心肌缺血再灌注損傷模型的建立 60只SD大鼠隨機取20只設為空白對照組，其余40只SD大鼠參與心肌缺血再灌注損傷模型建立，建模方法如下：采用改良墊扎球囊法完成SD大鼠動物模型建立。取參與建模的SD大鼠，采用0.35 mg/g濃度3.5%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉，待麻醉生效后進行常規(guī)消毒、鋪巾。取仰臥位姿勢，經(jīng)氣管插管后連接動物呼吸機，設定相關參數(shù)：潮氣量2～3 ml/100 g，頻率為80次/min，呼吸比為1∶1，連接Ⅱ導聯(lián)動態(tài)監(jiān)測大鼠心電圖。上述操作步驟完成后幫助SD大鼠快速開胸，將心包膜撕開后在左側心耳下緣、肺動脈圓錐部位采用6-0可吸收縫合線經(jīng)過左側冠狀動脈前降支深部完成心大靜脈、 注水球囊結扎。 將結扎線收緊，使得球囊壓迫左側冠狀動脈前降支，建立缺血模型。結扎完畢后缺血部位呈淺紅色，室壁運動減弱，導致心電圖下ST段升高。缺血30 min后迅速將球囊中水吸除，解除血管壓迫，對于缺血部位發(fā)紺消失、心電圖下ST段恢復正?；蛳陆?0.0%以上視為動物建模成功。心肌缺血再灌注損傷組建模后不采取任何措施處理干預；缺血后處理組建模成功后再進行30 s灌注、30 s缺血，連續(xù)進行3次處理[6，7]。

表1 主要儀器和試劑

1.2.2心功能測定 采用經(jīng)胸超聲心動圖對三組大鼠心臟功能進行評估，測量：左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、左室射血分數(shù)(LVEF)及左室短軸縮短率(LVFS)[8，9]。

1.2.3mir-499水平測定 ①組織中RNA的提取。三組大鼠建模、干預后以斷頸方式處死大鼠，去心肌部位組織，經(jīng)過PBS沖洗后加入500 μl Trizol吹打，使得組織充分溶解，加入500 μl Trizol充分混合、均勻。將上述溶液放入常溫下5 min，溶解蛋白體，加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩15 s，常溫下放置2～3 min，12 000 r/min離心15 min，獲得三層液體(上層為水相、中間層與下層為有機相)。取RNA沉淀，轉移到新的EP管中，加入0.5 ml異丙醇，充分混合后放置在-20℃冰箱中，12 000 r/min離心10 min，可見凝膠狀沉淀(即為RNA)。充分洗滌RNA，并加入250 μl DEPC與750 μl乙醇，利用乙醇完成沉淀的沖洗，7 400 r/min離心5 min，取沉淀放入工作臺上干燥20 min。利用紫外分光度儀檢測RNA濃度并完成RNA提純(以Rnase作為空白對照)，在A260下測定吸光度值。采用Dnase酶處理RNA，處理完畢后放入冰箱中，備用。②逆轉錄反應(完成cDNA的合成)。取獲得的RNA 1 μg、OligodT 1 μl，加水保證總體積為12 μl，充分混合后5 min水浴，冰上靜置1 min，加入5 μl緩沖液、1 μl Rninhib-itor及2 μl dNTP，保證總體溶液體積為12 μl，10 min 水浴，溫度設定為42℃，反應完畢后放置在-20℃冰箱中備用。③PCR反應。mir-499引物上游設定為：5′-GCCAGTTGTTTTTCTGATTTGTGGGCC-3′,下游引物設定為：5′-GCCAGTTGTTTTTCTG-CCAC-3′，為403 bp，hGAP-DH引物上游：5′-GGCTCTCCAGAACATCAT-3′，下游：5′-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3′，為240 bp。根據(jù)每一例標本情況設定反應條件：94℃下進行5 min變性，94℃下30 s、55℃下30 s、72℃ 1 min，連續(xù)進行35個循環(huán)，最后72℃下完成10 min延長。取hGAPDH為內參，選擇獲得的擴增產(chǎn)物，放入1.5%瓊脂凝膠進行電泳，完畢后采用UVP凝膠圖像完成灰度值的測定[10，11]。

1.2.4細胞免疫學水平測定 三組大鼠處理后7 d空腹狀態(tài)下經(jīng)尾部取靜脈血3 ml，5 000 r/min離心15 min，完成血清分離后放置在-20℃冰箱中，備用。采用流式細胞儀測定三組CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平，有關操作嚴格遵循儀器操作說明書完成[12，13]。

1.2.5相關性 采用SPSS Pearson相關性分析軟件對心肌缺血再灌注損傷大鼠mir-499水平與T淋巴細胞水平進行相關性分析。

2 結果

2.1三組心功能水平比較 見表2。三組手術前LVEDV、LVESV、LVEF及LVFS水平比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；缺血后處理組、空白對照組LVEDV水平無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；缺血后處理組灌注后LVESV水平，低于心肌缺血再灌注組(P<0.05)；缺血后處理組灌注后LVEF及LVFS水平，均高于心肌缺血再灌注組(P<0.05)。

表2 三組心功能水平比較

Note：Vs myocardial ischemia-reperfusion injury group，1)P<0.05；vs blank control group,2)P<0.05.

表3 三組mir-499表達比較

Note：Vs myocardial ischemia-reperfusion injury group，1)P<0.05；vs blank control group，2)P<0.05.

表4 心肌缺血再灌注損傷mir-499水平與免疫學指標相關性(r，P)

表5 三組大鼠細胞免疫學水平比較

Note：Vs myocardial ischemia-reperfusion injury group,1)P<0.05；vs blank control group,2)P<0.05.

2.2三組mir-499水平比較 見表3。缺血后處理組mir-499水平高于心肌缺血再灌注損傷組和空白對照組(P<0.05)；心肌缺血再灌注損傷組mir-499水平低于空白對照組(P<0.05)。

2.3心肌缺血再灌注損傷mir-499水平與免疫學指標相關性 見表4。SPSS Pearson相關性分析結果表明：心肌缺血再灌注損傷mir-499水平與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈負相關性(P<0.05)，與CD8+水平呈正相關性(P<0.05)。

2.4三組大鼠細胞免疫學水平比較 見表5。缺血后處理組、心肌缺血再灌注損傷組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，均高于空白對照組(P<0.05)；缺血后處理組、心肌缺血再灌注損傷組CD8+水平，均低于空白對照組(P<0.05)；缺血后處理組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注損傷組(P<0.05)；缺血后處理組CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注損傷組(P<0.05)。

3 討論

AMI是在冠狀動脈粥樣硬化病變的基礎上并發(fā)粥樣塊破裂、出血，血管腔內血栓形成，從而引起血管發(fā)生急性閉塞，導致心肌細胞進行性壞死[14,15]。目前，對于AMI以溶栓、經(jīng)皮冠脈介入治療為主，雖然改善冠狀動脈，促進血流恢復，降低臨床死亡率，但是臨床上不宜忽視由缺血引起的再灌注損傷[16]。從大的角度來說，缺血再灌注損傷是指機體遭受一段時間缺血組織恢復灌注后，缺血的組織損傷程度不但沒有得到緩解，反而急速加劇，能引起血管內皮功能障礙、收縮功能障礙[17,18]。但是，缺血再灌注損傷過程中對于組織造成損傷的并不是缺血本身，而是恢復灌注后大量鈣離子內流及過量的活性氧自由基產(chǎn)生，從而引起組織細胞凋亡。心肌梗死區(qū)域存在凋亡、壞死兩種細胞死亡形式，且多以凋亡為主(占80.0%以上)，而壞死僅占20.0%，并且多數(shù)由凋亡轉化而來。本研究中，缺血后處理組灌注后LVESV水平，低于心肌缺血再灌注組(P<0.05)；缺血后處理組灌注后LVEF及LVFS水平，均高于心肌缺血再灌注組(P<0.05)。由此看出：心肌缺血再灌注后心功能水平會發(fā)生明顯的改變，但是經(jīng)缺血再灌注后則能減輕心肌功能變化。由于缺血后處理組灌注后組織損傷并未得到緩解與改善，反而出現(xiàn)加重趨勢，導致心功能水平進一步降低。但是，經(jīng)過缺血后處理后機體心功能將會得到提高[19,20]。

microRNA是一種高度保守的內緣性小分子單鏈、非編碼的RNA，能通過靶mRNA特異性序列互補配對相互結合，從而能抑制靶基因的生成。同時，microRNA產(chǎn)生轉錄后能實現(xiàn)基因表達的調控[21,22]。國內學者研究表明：miRNA參與心肌缺血再灌注損傷，并且在IPC、IPO介導的心肌缺血損傷的保護中發(fā)揮作用[23]。mir-499是myomiRs家族一員，多表達于心肌、骨骼肌慢肌纖維組織中，而在其他組織中表達量相對較少，在人體心肌細胞分化、再生中均發(fā)揮了重要的作用[24,25]。生理條件下，內源性miRNA的表達能維持在一個恒定的水平，但是當受到病理或生理刺激時其表達水平能發(fā)生變化。本研究中，缺血后處理組mir-499水平高于心肌缺血再灌注損傷組和空白對照組(P<0.05)；心肌缺血再灌注損傷組mir-499水平低于空白對照組(P<0.05)。由此看出：mir-499水平在心肌缺血再灌注損傷患者中呈高表達，能參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展，能抑制PDCD4表達水平減少心肌細胞的凋亡，從而能改善缺血再灌注損傷大鼠心臟功能。

積極采取有效的措施防治心肌缺血再灌注損傷是提高心臟手術成功率，促進患者術后恢復的關鍵[26]。國外學者研究表明[27,28]：免疫、炎癥反應是心肌缺血再灌注損傷的重要機制。中性粒細胞是缺血再灌注損傷的主要炎癥細胞，但是最新研究表明CD3+、CD4+細胞在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮效應，盡早采取有效的措施抑制CD3+、CD4+細胞聚集能實現(xiàn)對缺血再灌注心肌的保護。本研究中，缺血后處理組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注損傷組(P<0.05)；缺血后處理組CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注損傷組(P<0.05)。由此看出：心肌缺血再灌注損傷加速了CD3+、CD4+細胞的聚集。國內學者研究表明[29]：缺血再灌注損傷整個過程中對于組織產(chǎn)生的損傷不是缺血本身，而是灌注過程中產(chǎn)生的大量鈣離子內流及氧自由基的大量產(chǎn)生。為了驗證心肌缺血再灌注損傷后處理方法，本研究中設立心肌缺血處理組，在大鼠心肌缺血后予以短暫的再灌注缺血循環(huán)，然后恢復灌注，結果表明：該后處理方法能縮小心肌梗死面積，實現(xiàn)心肌的保護，減輕缺血再灌注損傷，能為心肌缺血再灌注損傷治療提供方法和思路。本研究中，SPSS Pearson相關性分析結果表明：心肌缺血再灌注損傷mir-499水平與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈負相關性(P<0.05)，與CD8+水平呈正相關性(P<0.05)。因此，心肌缺血再灌注損傷治療過程中可以加強免疫細胞水平，評估治療預后，根據(jù)檢測結果調整治療方案，降低死亡率[30]。

綜上所述，心肌缺血再灌注損傷會引起mir-499表達降低，經(jīng)缺血處理后mir-499水平得到提高，有助于改善大鼠心臟功能，且與免疫學水平具有一定的相關性。