安康紫陽(yáng)富硒茶中茶多酚、茶氨酸分級(jí)提取及含量測(cè)定

靳文娟，謝娟平，魚(yú)亞楠，王 磊

(安康學(xué)院 秦巴中藥資源研發(fā)中心, 陜西 安康 725000)

安康紫陽(yáng)屬于中國(guó)最古老的北緣茶區(qū)，種茶歷史悠久，始于商周，興于盛唐，是中國(guó)最早的貢茶產(chǎn)地，加之紫陽(yáng)地區(qū)土壤富硒，茶葉達(dá)到了富硒標(biāo)準(zhǔn)，紫陽(yáng)富硒茶品質(zhì)優(yōu)良[1]。紫陽(yáng)縣現(xiàn)有茶園面積1.47萬(wàn)hm2，年產(chǎn)茶葉7 000余t，發(fā)展茶企300余家，茶葉的深加工是提高紫陽(yáng)富硒茶綜合利用的有效途徑之一[2]。

綠茶的主要活性物質(zhì)中，茶多酚(TP，約占茶葉干重的15%～25%)是形成茶葉色香味的主要成份之一，也是茶葉中有保健功能的主要成份之一，具有強(qiáng)的抗氧化和抗輻射作用[3]；茶氨酸(N-乙基-L-谷氨酰胺)是茶葉中特有的游離氨基酸，在干茶中占重量的1%～2%，具有調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)的變化、降血壓等作用[4～5]。

目前，茶多酚提取多以50%～70%的乙醇[6]或蒸餾水超聲輔助提取[7～8]、微波輔助提取[9]或超臨界流體提取[10]等為主，以高濃度(80%)乙醇冷浸提取的報(bào)道較少，茶氨酸的提取主要以加熱蒸餾水提取為主[11～13]，為了提高茶氨酸的提取率，綜合考慮茶多酚的提取，筆者設(shè)計(jì)了80%乙醇冷浸提取和超聲波輔助提取相結(jié)合的分級(jí)提取工藝，同時(shí)，設(shè)計(jì)分離純化工藝[14～15]，分別得到了茶多酚和茶氨酸粉末，為提高安康紫陽(yáng)富硒茶的綜合利用率提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

超聲波清洗器KH2200E(超聲頻率40KHz,超聲功率80W，加熱功率600W)昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52AA，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司，傅立葉紅外光譜儀FT-IR200美國(guó)Nicolet公司，雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，SP-1900，上海光譜儀器有限公司，高效液相色譜SPD-10AVP 日本島津，玻璃器包括：滲漏器、分液漏斗等。

茶葉為陜西省安康市本地紫陽(yáng)富硒茶，茶氨酸標(biāo)品購(gòu)自北京索來(lái)寶生物科技有限公司；二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、茚三酮、氯化亞錫、丙酮、溴化鉀、甲醇均為分析純，購(gòu)自天津市百世化工有限公司，聚酰胺(200-400目)樹(shù)脂、732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司、DEAE纖維素DE-52樹(shù)脂購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 茶多酚、茶氨酸的分級(jí)提取分離 取低溫烘干后的茶葉5.0 g，粗粉碎(過(guò)60目篩)，以料液比為1:25入80 % 的乙醇溶液125 mL于滲漏器中，浸泡24 h后，收集初漏液，再添加80% 的乙醇溶液，滲漏速度2 mL·min-1，收集續(xù)漏液，合并兩次滲漏液，0.08 MPa、50 ℃減壓濃縮，回收乙醇。

濾渣烘干后，稱重為3.1207 g，加入100 mL蒸餾水，在超聲波輔助條件下，70 ℃提取30 min，過(guò)濾，濾渣再加入50 mL蒸餾水，同樣條件下提取30 min，合并濾液，0.08 MPa、75 ℃減壓濃縮。

1.2.2 冷浸提液中茶多酚和茶氨酸的分離純化 乙醇冷浸提取濃縮液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，取上層液體減壓濃縮，回收乙酸乙酯后，逐滴滴加過(guò)預(yù)處理過(guò)的聚酰胺樹(shù)脂，柱內(nèi)保留時(shí)間為30 min，先用1.5倍體積的去離子水洗脫去除咖啡因，再用1.5倍柱體積的85%乙醇洗脫，將洗脫液用膠頭滴管每次吸取少量液體逐滴滴加過(guò)AB-8樹(shù)脂，柱內(nèi)保留時(shí)間30 min，用1.5倍柱體積的85%乙醇洗脫得到淡黃色液體，減壓濃縮回收乙醇，減壓濃縮，低溫干燥得到茶多酚粉末0.7420 g，得率14.84%。

乙酸乙酯萃取后的下層萃取液，減壓蒸餾，去除少量乙酸乙酯后，過(guò)732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，用pH=8的磷酸鹽溶液洗脫，收集洗脫液。

1.2.3 濾渣超聲水提液中茶氨酸的分離純化 將80%乙醇浸提后的茶葉渣(3.1207 g)，加水80 mL、70℃超聲輔助浸提50 min，提取2次，取濾液減壓濃縮后過(guò)DEAE樹(shù)脂，柱內(nèi)保留時(shí)間為30 min，流出液用膠頭滴管每次吸取少量液體逐滴滴加至732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，用pH=8的磷酸鹽溶液洗脫，得到洗脫液為茶氨酸富集液，合并冷浸提液萃取柱分離處理后的洗脫液，低溫烘干，得到白色粉末0.0407g，得率0.814%。

圖1 茶多酚、茶氨酸的分級(jí)提取、分離純化流程

1.3 紅外光譜表征

采用KBr壓片法，分別對(duì)從安康紫陽(yáng)富硒茶中分級(jí)提取分離得到的茶多酚樣品、茶氨酸樣品進(jìn)行紅外光譜分析，明確特征官能團(tuán)的吸收峰。

1.4 含量的測(cè)定

1.4.1 茶多酚含量測(cè)定 建立高效液相色譜法條件，對(duì)乙醇冷浸提液和超聲水提取液中茶多酚的含量進(jìn)行分析。高效液相色譜條件：C18色譜柱，柱溫25 ℃，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm，流動(dòng)相：A:甲醇；B:0.1%磷酸水溶液(A:B = 28:72)，流速1.0 mL·min-1。

標(biāo)品溶液的制備：精密稱取茶多酚標(biāo)品粉末25.0 mg，于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解后，置于超聲條件下30 min，定容，以0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為樣品儲(chǔ)備液備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，分別取標(biāo)品儲(chǔ)備液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL定容至25 mL，取10μL 進(jìn)樣。

樣品溶液的制備：冷浸提液和超聲水提取液，各取10 mL，以0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為樣品供試液，取1μL 進(jìn)樣。

1.4.2 茶氨酸含量的測(cè)定 采用茚三酮比色法測(cè)定茶氨酸的含量。

標(biāo)品的制備：準(zhǔn)確稱取茶氨酸標(biāo)品5.0 mg，加1 mL蒸餾水加熱溶解，定容至25 mL。

茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取標(biāo)品溶液0、1、2、3、4、5 mL，加PH=8的磷酸鹽緩沖溶液2 mL，2%茚三酮溶液 1mL，沸水加熱15 min，自然冷卻10 min，加蒸餾水定容至25 mL，570 nm處測(cè)吸光度。

分別取冷浸提液3 mL、超聲水提取液3 mL，加緩沖溶液2 mL，2%茚三酮溶液 1mL，沸水加熱15 min，自然冷卻10 min，加蒸餾水定容至25 mL，570 nm處測(cè)吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

對(duì)分級(jí)分離純化后所得的茶多酚和茶氨酸粉末進(jìn)行紅外光譜分析。

茶多酚樣品的紅外光譜圖如圖2所示，在3 200～3 600 cm-1的寬吸收峰為苯環(huán)上的羥基吸收峰，1 300～1 350 cm-1是茶多酚中表兒茶素沒(méi)食子酸酯和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的酯基吸收峰，1 000～1 300 cm-1左右為羥基的變形振動(dòng)，700～850 cm-1處可能是由1,3二取代苯上的-C-H變形振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰。

茶氨酸樣品的紅外光譜圖如圖3所示，3 300～3 500 cm-1的吸收峰為酰胺鍵上N-H的伸縮振動(dòng)，2 850～3 000 cm-1的寬吸收峰為-CH3基、-CH2基的伸縮吸收，1 500～1 750 cm-1的吸收峰為C=O的伸縮振動(dòng)，1 000～1 350 cm-1左右為C-N伸縮振動(dòng)吸收。

圖2 茶多酚樣品紅外光譜

圖3 茶氨酸樣品紅外光譜

2.2 含量測(cè)定數(shù)據(jù)及分析

2.2.1 茶多酚標(biāo)品的高效液相圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 茶多酚標(biāo)品的高效液相圖譜

圖5 茶多酚標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相條件下，測(cè)得茶多酚標(biāo)品的高效液相色譜圖如圖4所示，共有7個(gè)峰反應(yīng)了茶多酚的主要組成，采用保留時(shí)間定性，面積加和后進(jìn)行外標(biāo)法計(jì)算含量，茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到乙醇浸提液和超聲水提液中茶多酚的含量分別為0.7162 g(占茶葉原重的14.32%)和0.03949 g(占茶葉原重的0.7898%)。

2.2.2 茶多酚和茶氨酸的含量分析 由表2的數(shù)據(jù)可見(jiàn)，采用80%乙醇提取和超聲輔助水提的分級(jí)提取方法，在乙醇浸提液中茶多酚的含量為716.1132 mg，茶氨酸的含量為11.7589 mg；超聲濾渣超聲水提液中茶多酚的含量為39.4878 mg，茶氨酸的含量為38.4665 mg。實(shí)驗(yàn)共稱取了5.0 g 安康紫陽(yáng)富硒茶，采用分級(jí)提取的方法可知：茶多酚的總含量為755.6010 mg，占茶葉總重量的15.11%；茶氨酸的總含量為50.2254 mg，占茶葉總重量的1.005%。

表1 茶多酚含量的高效液相數(shù)據(jù)

表2 茶多酚、茶氨酸含量數(shù)據(jù)

注：百分提取率為含量占茶葉原質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)。

3 結(jié)論

茶多酚和茶氨酸是茶葉的主要活性物質(zhì)，也是提高茶葉綜合開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的主要產(chǎn)品，安康茶葉資源豐富，紫陽(yáng)富硒茶(綠茶)是安康茶葉中的佼佼者，為了提高其中茶多酚和茶氨酸的綜合提取率，本文設(shè)計(jì)了乙醇(85%)冷浸提取和超聲水提相結(jié)合的分級(jí)提取方式，建立了高效液相分析法和茚三酮顯色法分析法相結(jié)合的表征方法，分別檢測(cè)分級(jí)提取液中茶多酚和茶氨酸的含量，可為下一步分離純化提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

分析得到的含量數(shù)據(jù)可知：冷浸提法一級(jí)提取液中茶多酚的含量高，占到茶葉干重的15.11%，同時(shí)有少量茶氨酸可從中分離得到；冷浸提后的濾渣經(jīng)過(guò)超聲輔助水提后，可得到二級(jí)提取液，其中茶多酚的含量低(占茶葉干重的0.7898%)，茶氨酸含量占茶葉干重的1.005%。提取液經(jīng)萃取和柱分離相結(jié)合的方式純化后，干燥，得到茶多酚粉末0.7420 g，得率14.84%，茶氨酸白色粉末0.0407g，得率0.814%。該分級(jí)提取工藝實(shí)現(xiàn)了茶多酚和茶氨酸的綜合提取，提取效率高，設(shè)備簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，具有一定的小試放大價(jià)值。