基于matK序列的婆婆納屬部分植物親緣關(guān)系分析

許 靜，趙月梅

(1.西安市第十中學，陜西 西安 710014；2.商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

婆婆納屬(Veronica)植物屬于玄參科，約有250個種[1]，廣布全球，主產(chǎn)于歐亞大陸。我國有61種，各省均有分布，主產(chǎn)于西南山地。該屬植物中，有外來雜草，如睫毛婆婆納(V.hederifolia)、波斯婆婆納(V.persica)；有傳統(tǒng)藥用植物，如水苦荬(V.undulate)、婆婆納(V.didyma)等。具有止血活血，清熱解毒，生肌，祛風利濕等功效[1]，本屬植物多生于灌木叢、樹林下以及河溝、山谷旁。

據(jù)《中國植物志》[2]記載，中國的婆婆納屬植物共分為8個組，分別為：穗花組、頭花組、小婆婆內(nèi)組、蚊母草組、婆婆納組、沼生組、狹果組、疏花組。一般認為，除了狹果組外，其余種內(nèi)和種間之間的界限均比較清楚。形態(tài)上鑒別婆婆納屬植物的方法主要為葉的形態(tài)，葉柄，花柄，果柄的長短，花的顏色大小，果的形態(tài)以及葉柄根的構(gòu)造，葉片上下表皮的氣孔數(shù)目等性狀[3]。但是有些物種由于分布廣，不同分布區(qū)環(huán)境存在差異，為了適應當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境，該物種的相關(guān)性狀在不同類群之間會呈現(xiàn)不連續(xù)性。加上物種分化時間短，近緣物種之間存在基因流等原因，導致部分物種的種間關(guān)系比較模糊。因此僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒別手段，很難對該屬物種進行精確的區(qū)分[4～5]。

隨著測序技術(shù)及分子生物學、分子系統(tǒng)學等學科的發(fā)展，在DNA水平上，利用合適的分子標記對近緣物種進行種間及種內(nèi)序列分析，是解決物種間系統(tǒng)關(guān)系及分類的有效方法[6～10]。葉綠體matK基因是植物學系統(tǒng)分析中常用的序列之一，研究表明，該基因編碼的酶參與RNA轉(zhuǎn)錄體中Ⅱ型內(nèi)含子的剪切[11]，且由于該基因的變異較均一，在構(gòu)建系統(tǒng)進化樹時能提高聚類樹的可靠性[11]，近年來廣泛應用在了不同植物屬內(nèi)種間、種下的系統(tǒng)發(fā)育系研究[12-19]。研究擬利用matK基因分析婆婆納屬部分植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，旨在探討該屬植物的在形態(tài)上難以解決的種間親緣關(guān)系和分類界限，為該屬植物的傳統(tǒng)分類學及進一步應用和保護提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

本研究采用了婆婆納屬植物的16個種(36條matK序列)，其中婆婆納，阿拉伯婆婆納，北水苦荬樣品采集自陜西商洛，其余13個物種的序列均從NCBI下載，上述3個物種的樣品經(jīng)野外采集新鮮葉片后，裝入采集袋中用硅膠快速干燥，備用。

1.2 總DNA提取PCR擴增及序列測定

將婆婆納、阿拉伯婆婆納、北水苦荬三個物種的干燥葉片用天根公司植物DNA 提取試劑盒(Tiangen Biotech Co., China)提取樣品總DNA。PCR擴增的引物及擴增條件及擴增體系參考以前研究成果[20]。擴增、純化得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至上海生物工程技術(shù)服務有限公司進行單向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測序所得序列和下載序列進行整理后構(gòu)建FASTA格式的文件，用Clustal 2.0[21]軟件進行比對后截掉前后多余的序列，組成長度一致的矩陣，備用。用Bioedit[22]軟件和Mega6.0[23]軟件進行序列變異位點的分析，并計算種間及種內(nèi)距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 婆婆納屬樣品來源

注：*表示該物種目前無中文名稱

2 結(jié)果與分析

2.1 matK序列堿基組成分析

將得到的matK序列進行剪切，序列比對及后獲得約733 bp長度的序列，發(fā)現(xiàn)該序列存在多處變異位點及1處插入缺失位點(圖1)。其中序列中T、G、A、C的平均含量分別為36.9%、17.5%、28.9%、16.6%，變異位點167個，約占總序列的22.78%，整個matK區(qū)的變異位點豐富，可以較好地區(qū)分不同種質(zhì)來源的婆婆納屬植物。

(1)在種內(nèi)，其中婆婆納、阿拉伯婆婆納、北水苦荬、每條序列完全相同，即這些物種無種內(nèi)變異:；睫毛婆婆納在86位點發(fā)生了種內(nèi)變異(A-G)；石蠶葉婆婆納在667位點出現(xiàn)了變異(T-G)；有柄水苦荬在435位點出現(xiàn)了堿基缺失。

(2)在種間，睫毛婆婆納、V.Spicata、V.Barrelieri、在148位點出現(xiàn)了變異(G-A)；阿拉伯婆婆納、有柄水苦荬在624位點出現(xiàn)了變異(G-T)；小婆婆納、睫毛婆婆納、在624位點出現(xiàn)了變異(G-A)；石蠶葉婆婆納在624位點出現(xiàn)了變異(G-C)。

圖1 婆婆納屬16個物種matK序列信息

2.2 matK序列遺傳距離分析

用Mega6.0軟件計算的婆婆納屬16個種的種間遺傳距離(表2)：16個婆婆納屬植物的遺傳距離范圍在0.002-0.101之間，其中1與15之間，即藥用婆婆納V.Officinalis和V.Dabneyi之間遺傳距離最小，為0.002，表明二者親緣關(guān)系較近，其次2(美洲婆婆納V.Americana)與7(有柄水苦荬V.Beccabunga)之間、9(北水苦荬V.Anagallis-aquatica)與12(V.Catenata)之間、10(穗花婆婆納V.Spicata)與14(V.Barrelieri)之間遺傳距離都比較小，分別為0.003、0.003、0.004。另外，4(婆婆納V.Polita)和8(睫毛婆婆納V.Hederifolia)之間遺傳距離最大，為0.101，表明二者親緣關(guān)系最遠。

表2 基于matK序列的婆婆納屬種間的K2P遺傳距離統(tǒng)計結(jié)果

注：1-16個種的順序同表1

圖2為種間距離和種內(nèi)距離的頻率分布圖，由此可知，matK序列在婆婆納屬中的種內(nèi)距離集中在0%～0.5%區(qū)間，種間距離集中在0.5%之后，二者在0.5%～1.0%區(qū)間有少許重疊，且無論種內(nèi)距離還是種間距離在該區(qū)間的分布都較少(小于10%)，表明matK序列在婆婆納屬的遺傳距離分布上比較好：即種內(nèi)距離偏小而種間距離偏大，適合做系統(tǒng)發(fā)育和分類分析。

圖2 婆婆納屬植物種內(nèi)、種間的遺傳距離分布頻度柱形圖(其中橫坐標為遺傳距離，縱坐標為該遺傳距離的分布頻率)

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

由Mega 6.0軟件基于鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示，16個種的36條序列能將每個物種分別聚成一個單系，且支持率較高。其中睫毛婆婆納位于枝的最底端，表明該物種在該屬中較為原始，與其他物種關(guān)系較遠；剩下的分枝中，石蠶葉婆婆納，婆婆納和阿拉伯婆婆納三個物種聚為一支，同時，剩下的12個物種聚為一支，二者形成并系，表明兩個分枝間存在平行進化關(guān)系。在阿拉伯婆婆納的分枝中，婆婆納與石蠶葉婆婆納關(guān)系較近，二者聚為一支，同時與阿拉伯婆婆納形成并系；在12個物種形成的分枝中，形成2個亞分支，亞分支1：有柄水苦荬、美洲婆婆納、V.Catenata、北水苦荬、蚊母草、小婆婆納、V.Barrelieri和穗花婆婆納聚為一個亞分支，其中，有柄水苦荬與美洲婆婆納之間親緣關(guān)系較近，V.Catenata與北水苦荬之間親緣關(guān)系較近，蚊母草，小婆婆納、穗花婆婆納和V.Barrelieri依次關(guān)系較遠。亞分支2：其余的物種V.Scutellata、藥用婆婆納、V.Dabneyi和V.Montana聚為另一個亞分支，其中V.Dabneyi和V.Montana關(guān)系較近，隨后依次為藥用婆婆納、V.Scutellata物種。由此可知使用matK序列可以在系統(tǒng)發(fā)育上闡明婆婆納屬這16個物種的親緣關(guān)系，且大部分分支支持率較高。

圖3 基于matK序列的婆婆納屬系統(tǒng)發(fā)生樹(注：1-16物種順序見表1)

3 結(jié)論

本文利用matK序列分析了婆婆納屬16個物種(共36條序列)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其中包括序列特征、K2P距離及系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明：從實驗過程上來說，野外采集的北水苦荬、婆婆納和阿拉伯婆婆納3個物種在DNA提取及PCR擴增過程中均表現(xiàn)良好，通用引物在該屬這3個物種中均能正常使用，在上述的反應條件和反應體系均能很好的擴增條帶并正常測序，表明這3個物種區(qū)段的引物結(jié)合區(qū)域未出現(xiàn)變異等情況，可正常結(jié)合并擴增。在采樣不足的情況下，在Genbank中也有豐富的序列信息可供參考。從序列對比上來看，對比后的總長度為733 bp，相對于其他物種來說，序列長度屬中等，1個插入缺失序列，167個變異位點，表明該屬的物種進化較快。種內(nèi)距離集中在0.5%以內(nèi)，種間距離集中在0.5%以外，表明該序列在種內(nèi)距離小在種間距離大，比較適合做系統(tǒng)發(fā)育分析。最后聚類樹分析也表明該屬物種中睫毛婆婆納較為原始，阿拉伯婆婆納、婆婆納和石蠶葉婆婆納與剩余的12個物種呈現(xiàn)平行進化趨勢。

婆婆納屬植物分布廣泛，在全世界各地均有分布，其中有重要的中藥材，也有用于園林，環(huán)保等方面的重要植物，而該屬植物多為草本，形態(tài)上有很多相似之處，因此在分類上造成了很多互相混淆的現(xiàn)象，尤其是廣布于的婆婆納和阿拉伯婆婆納物種，在非花期和果期很難將二者進行準確的區(qū)分。而利用各種分子標記的方法則有助于在宏觀分類方面區(qū)分這些形態(tài)上和進化上相似的物種，同時也可以闡明近緣物種間的復雜的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，matK序列在該領(lǐng)域中是一種常用的序列，在很多藥材及園林植物中都得到了重要的應用，本文的研究除了闡明婆婆納屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系外，同時能夠為matK序列的應用范圍和鑒定能力提供一個很重要的參考依據(jù)。