肌肽納米脂質(zhì)體改善人成纖維細(xì)胞抗氧化性能研究

羅 丹，洪延涵，梁 明，尹西拳，聞 慶，劉 衛(wèi),4

（1.華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.武漢百思凱瑞生物科技有限公司，湖北 武漢 430075；3.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510665；4.華中科技大學(xué) 國家納米藥物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075）

肌肽是近年來被廣泛研究的一類天然活性肽，具有抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞能量代謝等作用[1]，肌肽還可以改善細(xì)胞正常功能，使衰老細(xì)胞年輕化[2]，因此被廣泛應(yīng)用在抗衰類護(hù)膚化妝品中。納米脂質(zhì)體是一種能把活性成分包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)的微型泡囊體，無刺激性，易降解，具有良好的靶向性、緩釋性優(yōu)點(diǎn)[3,4]。研究表明，納米脂質(zhì)體可顯著提高護(hù)膚活性成分的穩(wěn)定性，促進(jìn)其透皮吸收[5,6]，顯著改善護(hù)膚功效。細(xì)胞模型可以較好的評價(jià)活性物質(zhì)的生理活性，采用細(xì)胞抗氧化模型評估活性物經(jīng)納米脂質(zhì)體包埋后的抗氧化活性變化比體外化學(xué)抗氧化更具體意義。Hu[7]認(rèn)為EGCG殼聚糖多肽納米粒具有更高的細(xì)胞抗氧化活性是因?yàn)闅ぞ厶嵌嚯募{米粒包埋能夠顯著提高EGCG在細(xì)胞培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性，殼聚糖多肽納米粒能順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，增加活性物的抗氧化性。因此本文采用高壓勻質(zhì)技術(shù)制備肌肽納米脂質(zhì)體，對其理化性能和穩(wěn)定性進(jìn)行研究，比較了游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體的體外透皮性能和體外細(xì)胞水平抗氧化性能，為肌肽納米脂質(zhì)體應(yīng)用于抗衰老化妝品提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

肌肽，南京萊昂生物科技有限公司；大豆卵磷脂，北京美亞斯磷脂有限公司； 膽固醇，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；人成纖維細(xì)胞（HSF），昆明細(xì)胞庫；0.25%胰酶-EDTA、DMEM（高糖型）液體培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS），Gibco公司；H2O2溶液，阿拉丁試劑有限公司；細(xì)胞活力檢測試劑盒（CCK-8），日本Dojindo公司；BCA蛋白定量試劑盒，碧云天生物技術(shù)公司；SOD測定試劑盒、CAT測定試劑盒、MDA測定試劑盒，南京建成生物科技有限公司；SPF級SD雄性大鼠（200～220 g），購于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2015-0018）。

JN-02HC高壓納米均質(zhì)機(jī)，廣州聚能生物科技有限公司；Zetasizer/Nano-ZS90 納米電位粒徑分析儀，英國Malvern公司；Tecnai G220透射電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；Agilent 1260高效液相色譜儀（HPLC），美國安捷倫公司；TK-12D透皮擴(kuò)散儀，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司；Victor多標(biāo)記分析儀，珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌肽納米脂質(zhì)體的制備

稱取處方量磷脂、膽固醇于適量乙醇中，65 ℃下恒溫水浴溶解后降溫至45 ℃，磁力攪拌15 min后依次勻速加入處方量的丙二醇、甘油、肌肽和水，邊加邊攪拌，快速混勻后即得初乳。將初乳于剪切機(jī)中剪切10 min后得到微米級分散體，再于高壓均質(zhì)機(jī)中120 MPa進(jìn)行3次循環(huán)均質(zhì)處理即得肌肽納米脂質(zhì)體。

1.2.2 肌肽納米脂質(zhì)體的理化性質(zhì)表征

1）粒徑與Zeta電位。取適量肌肽納米脂質(zhì)體，超純水稀釋一定倍數(shù)，使樣液的平均光強(qiáng)為150～300。用納米電位粒徑分析儀測定粒徑、多分散性系數(shù)（PDI）和Zeta電位，粒徑測定角度為 90°，測試溫度為 25 ℃。

2）載藥量與包封率。HPLC分析方法：選用Sepax HPAmino色譜柱，以乙腈與30 mmol/L磷酸氫二鉀水溶液（磷酸調(diào)pH至6.8，體積比為65∶35）為流動(dòng)相進(jìn)行分析， 214 nm處檢測肌肽，柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

用超濾離心法分離納米脂質(zhì)體和游離肌肽[7]。精確移取制備好的肌肽納米脂質(zhì)體0.5 mL，置于超濾離心管中（截流相對分子質(zhì)量為3 kD），經(jīng)12 000 r/min離心30 min，收集濾液用HPLC測得游離肌肽含量，按下列公式計(jì)算包封率和載藥量。

式中，Wt為投藥量，Wf為游離肌肽含量，Wl為膜材含量。

3）微觀形貌。取肌肽納米脂質(zhì)體以超純水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取1滴置于覆有Formvar膜的銅網(wǎng)上，自然干燥后滴加1滴2%磷鎢酸溶液負(fù)染1～2 min，用濾紙吸干多余液體，晾干后置透射電子顯微鏡下觀察其微觀形態(tài)。

1.2.3 肌肽納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定性

將制備的肌肽納米脂質(zhì)體置于常溫避光、4 ℃避光、45 ℃避光和光照條件下存放，分別于30 天、60天、90天取出測定并考察其粒徑、PDI和Zeta電位的變化情況。

1.2.4 體外透皮性能測試

取一定量的肌肽原料藥和肌肽納米脂質(zhì)體分別加入到空白膏霜中，攪拌混勻得到相同肌肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的原料藥霜?jiǎng)┖图{米脂質(zhì)體霜?jiǎng)⒄瘴墨I(xiàn)[8]采用垂直式Franz擴(kuò)散池法進(jìn)行離體鼠皮的透皮實(shí)驗(yàn)，將完整無破損的大鼠腹部皮膚固定于接收池和供給池間，取上述霜?jiǎng)└? g于供給室中，以含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%丙二醇的生理鹽水為接收液，37 ℃下300 r/min攪拌。于1 ，2 ，4 ，6，8，10 ，12 h吸取接收液0.5 mL，并補(bǔ)充等溫空白接收液0.5 mL，HPLC檢測，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)藥物累積透過量，計(jì)算公式為：

式中，Qn為藥物累計(jì)透過量，Cn為第n次測得的藥物濃度，Ci為第i個(gè)點(diǎn)所測得的藥物濃度，V0為擴(kuò)散池的體積即加入釋放介質(zhì)的量，Vi為每次取樣的量。單位面積累計(jì)滲透量Q=Qn/S， S為擴(kuò)散池的面積， 3.14 cm2。

透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下皮膚，用超純水洗去樣品殘液后剪碎，轉(zhuǎn)入組織勻漿器中充分研磨成勻漿液，加適量接收液轉(zhuǎn)移至離心管中，7 000 r/min 離心20 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾后HPLC分析，計(jì)算皮膚中肌肽滯留量。

1.2.5 抗氧化功效評價(jià)

肌肽納米脂質(zhì)體用DMEM培養(yǎng)基稀釋后，測定并考察其粒徑、PDI和Zeta電位的變化情況，脂質(zhì)體穩(wěn)定無聚集現(xiàn)象方可進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1）肌肽納米脂質(zhì)體對HSF細(xì)胞增殖的影響。采用CCK-8法測定HSF細(xì)胞活力[9]，將HSF細(xì)胞用1 mL 0.25%的胰蛋白酶溶液消化3 min后加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再將HSF細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為6×103個(gè)/孔，待HSF細(xì)胞貼壁后，對照組加培養(yǎng)基，給藥組加入100 μL含有游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體的培養(yǎng)液，稀釋至肌肽終質(zhì)量濃度分別為25，50，100，200，400 mg/L，培養(yǎng)24 h后每孔加入CCK-8試劑10 μL，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，450 nm波長下測OD值，測定HSF細(xì)胞活力。

2）肌肽納米脂質(zhì)體對H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞氧化損傷的影響[10]。將HSF細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為6×103個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后，對照組加培養(yǎng)基，模型組加入0.8 mmol/L的H2O2，給藥組加入0.8 mmol/L的H2O2同時(shí)加入肌肽終質(zhì)量濃度分別為25，50，100，200，400 mg/L的游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體共培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后用CCK-8法測定HSF細(xì)胞活力。

3）MDA、SOD、CAT生化指標(biāo)的測定。將HSF細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度為3×105個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后對照組加培養(yǎng)基，模型組加入0.8 mmol/L的H2O2，給藥組加入0.8 mmol/L的H2O2同時(shí)加入肌肽終質(zhì)量濃度分別為50 mg/L和200 mg/L的游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體共培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，加入500 μL蛋白裂解液[11]，反復(fù)凍融3次將細(xì)胞裂解，12 000 r/min離心 5 min 后收集裂解產(chǎn)物備用，采用BCA法測定蛋白濃度。分別采用細(xì)胞丙二醛（MDA）測試盒、SOD 活性檢測試劑盒和CAT檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)MDA含量，SOD和CAT酶活力水平，具體操作步驟按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示，不同肌肽納米脂質(zhì)體濃度處理間的差異采用one-way ANOVA進(jìn)行比較分析，以P＜0.05為差異顯著，最終處理結(jié)果用origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化性質(zhì)

肌肽納米脂質(zhì)體為黃色透明澄清液體，測得其粒徑為65.5 nm，PDI為0.290，Zeta電位為-43.6 mV，測得肌肽包封率為67.0%，載藥量為6.6%。肌肽納米脂質(zhì)體粒徑分布見圖1。

利用透射電子顯微鏡觀察得到肌肽納米脂質(zhì)體的微觀形貌見圖2所示。由圖2可知，肌肽納米脂質(zhì)體在透射電鏡下基本呈圓形，未見脂質(zhì)體集聚現(xiàn)象，平均粒徑為60～70 nm，粒徑比較均勻。放大其中一個(gè)脂質(zhì)體觀察其微觀結(jié)構(gòu)，可以看到藥物溶液僅僅被一層類脂雙分子層膜包裹，為典型的單室脂質(zhì)體。該種脂質(zhì)體有效體積小，比多室脂質(zhì)體和大的多孔脂質(zhì)體更容易釋放有效包封物，并且能滲透到角質(zhì)層或更深的皮層[12]。

圖2 肌肽納米脂質(zhì)體透射電鏡圖Fig.2 TEM image of carnosine nanoliposome

2.2 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。在4個(gè)條件下考察90 天發(fā)現(xiàn)，制備得到的肌肽納米脂質(zhì)體粒徑和Zeta電位變化不大；置于45 ℃、光照保存的載體PDI變大，說明該條件下儲(chǔ)存載體有團(tuán)聚傾向，可能是貯存溫度過高，導(dǎo)致脂質(zhì)膜流動(dòng)性增加，脂質(zhì)體穩(wěn)定性降低，故最佳貯藏環(huán)境為避光、4 ℃保存。

表1 肌肽納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性Tab.1 Stability of carnosine nanoliposome

2.3 體外透皮性能

肌肽普通霜?jiǎng)┘凹{米脂質(zhì)體霜?jiǎng)?2 h皮膚累積透過量及皮膚滯留量的測定結(jié)果見圖3。由圖3可知，肌肽普通霜?jiǎng)┖图‰募{米脂質(zhì)體霜?jiǎng)┢つw累積透過量分別為144.83 μg/cm2和92.32 μg/cm2，皮膚滯留量分別為8.44 μg/cm2和16.08 μg/cm2。肌肽納米脂質(zhì)體皮膚透過量更小，能夠?qū)⒏邼舛燃‰木徛尫?，避免滲透量過高導(dǎo)致活性物質(zhì)流失；納米脂質(zhì)體滯留量更高，能有效促進(jìn)肌肽在皮膚中的高濃度滯留，提高其生物利用率。

圖3 藥物體外皮膚累積透過量及滯留量Fig.3 Cu mulative permeation and retention of carnosine through/in mouse skin in vitro

2.4 體外抗氧化研究

2.4.1 對HSF細(xì)胞增殖的影響

不同質(zhì)量濃度的游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體處理HSF細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力變化見圖4。由圖4可知，游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體添加量為25～400 mg/L時(shí)，與對照組比較，HSF細(xì)胞活力為90%～110%，說明游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體對HSF細(xì)胞的細(xì)胞活力無顯著影響。

圖4 游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體對HSF細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Ef fects of free carnosine and carnosine nanoliposome on the proliferation of HSF cells

2.4.2 對H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞活力的影響

不同質(zhì)量濃度游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體對H2O2誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞活力影響見圖5。由圖5可知，模型組HSF細(xì)胞經(jīng)0.8 mmol/L的H2O2誘導(dǎo)后，細(xì)胞活力降低，為63.97%；加入質(zhì)量濃度為25～400 mg/L的肌肽納米脂質(zhì)體后，與模型組相比，HSF細(xì)胞活力上升具有顯著性（P＜0.05）；與游離肌肽組相比，細(xì)胞活力上升具有顯著性（P＜0.05）

圖5 游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體對H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞活力的影響Fig.5 Ef fects of free carnosine and carnosine nanoliposome on H2O2-induced HSF cell vitality

2.4.3 MDA、SOD、CAT生化指標(biāo)的變化

MDA可引起脂質(zhì)過氧化作用，進(jìn)而形成過氧化物，其含量的多少直接影響機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，從而間接反映細(xì)胞損傷的程度[13]。游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體對H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞中MDA含量的影響見圖6。由圖6可以看出，與對照組比較，模型組HSF細(xì)胞經(jīng)0.8 mmol/L的H2O2誘導(dǎo)后，MDA含量從對照組的1.86 nmol/L上升至5.93 nmol/L；與模型組比較，加入不同質(zhì)量濃度的游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體均可不同程度抑制MDA含量，且具有顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)添加量分別為50 mg/L和200 mg/L時(shí)，與游離肌肽組相比，肌肽納米脂質(zhì)體的作用的HSF細(xì)胞分泌的MDA含量減少，且具有顯著性（P＜0.05），表明肌肽納米脂質(zhì)體對抗脂質(zhì)過氧化的作用優(yōu)于游離肌肽。

圖6 游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體對H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞中MDA含量的影響Fig.6 Ef fects of free carnosine and carnosine nanoliposome on the MDA content in HSF cells induced by H2O2

超氧化物歧化酶（SOD）能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞[14]。過氧化氫酶（CAT）是過氧化物酶體的標(biāo)志酶，是催化過氧化氫分解成氧和水的酶，存在于細(xì)胞的過氧化物體內(nèi)。SOD和CAT是細(xì)胞中直接的內(nèi)源性抗氧化劑[15]，本文研究了肌肽納米脂質(zhì)體在氧化應(yīng)激條件下對細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的影響。不同質(zhì)量濃度的肌肽納米脂質(zhì)體作用于H2O2誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞后，對細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活力的影響見圖7和圖8。

由圖7可以看出，與對照組相比，用0.8 mmol/L H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞后，模型組HSF細(xì)胞內(nèi)SOD活力由294.01 U/mg降低到90.73 U/mg；與模型組比較，不同質(zhì)量濃度游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體處理HSF后均明顯提高細(xì)胞裂解液中SOD活力，且具有顯著性差異（P＜0.05）；當(dāng)肌肽質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，與游離肌肽組相比，肌肽納米脂質(zhì)體作用的HSF細(xì)胞SOD活力上升，且具有顯著性差異（P＜0.05），表明肌肽納米脂質(zhì)體提高SOD酶活的能力優(yōu)于游離肌肽，更大程度降低H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激傷害。

由圖8可以看出，與對照組相比，用0.8 mmol/L H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞，模型組HSF細(xì)胞內(nèi)CAT活力由23.68 U/mg降低到11.49 U/mg；與模型組比較，不同質(zhì)量濃度游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體處理HSF后均明顯提高細(xì)胞裂解液中CAT活力，且具有顯著性差異（P＜0.05），當(dāng)肌肌肽質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，與游離肌肽組相比，肌肽納米脂質(zhì)體的CAT活力上升，且具有顯著性差異（P＜0.05），表明肌肽納米脂質(zhì)體提高CAT酶活的能力優(yōu)于游離肌肽。

圖7 游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體對H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞中SOD活力的影響Fig.7 Ef fects of free carnosine and carnosine nanoliposome on the SOD activity in HSF cells induced by H2O2

圖8 游離肌肽和肌肽納米脂質(zhì)體對H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞中CAT活力的影響Fig.8 Ef fects of free carnosine and carnosine nanoliposome on the CAT activity in HSF cells induced by H2O2

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所制備的肌肽納米脂質(zhì)體為球形或橢圓形顆粒，包封率為67.0%，平均粒徑為65.5 nm，Zeta電位為-43.6 mV，避光低溫下儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。納米脂質(zhì)體能改善肌肽的透皮吸收性能，顯著增強(qiáng)其皮膚靶向滯留能力，相對于游離肌肽具有更好的細(xì)胞抗氧化性能。因此，肌肽納米脂質(zhì)體在抗衰護(hù)膚化妝品中具有良好的應(yīng)用前景。