京墨中有害元素的含量測(cè)定及揮發(fā)油成分分析

*

1.西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院，西藏 拉薩 850000；2.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

京墨又稱“京香墨”、“青墨”或“香墨”，由松煙末和膠質(zhì)制成。京墨藥用歷史悠久，首載于唐代《本草拾遺》[1]，同時(shí)京墨也是常用藏藥[2]。經(jīng)由歷代各民族本草記載可知京墨味辛，性溫，無毒，歸肝、腎經(jīng)[3-4]。其藥用功效豐富，不僅可止血消腫，還能治鼻衄、產(chǎn)后血暈、飛絲入目等，現(xiàn)代研究表明京墨亦可用于治療帶狀孢疹[5-6]。微量元素在人體中的含量直接影響人體生理功能，與機(jī)體的活動(dòng)狀態(tài)及疾病密切相關(guān)[7]，藥物中過量的微量元素尤其是重金屬的含量超標(biāo)會(huì)損害人的健康，需要制定嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來限制[8]。京墨作為傳統(tǒng)口服類藥物，目前有關(guān)京墨的各項(xiàng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)均未見研究報(bào)道。而當(dāng)今制墨所用的原料與工藝與古制京墨皆有差別[9-10]。為保證京墨的品質(zhì)及入方藥用安全，本試驗(yàn)以電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法(ICP-AES法)測(cè)定7批京墨樣品中Sb、As、Pb、Cr、Cd、Cu元素的含量，并以原子熒光光度法測(cè)定其中Hg元素含量；同時(shí)以GC-MS法對(duì)京墨中的揮發(fā)油化學(xué)成分的組成進(jìn)行分析，為規(guī)范完善京墨的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 京墨藥材(批號(hào)：JM1、JM2、JM3、JM4、JM5、JM6、JM7，四川天利和藥業(yè)有限公司和安徽徽州)。鎘標(biāo)準(zhǔn)液(批號(hào)：GSB 04-1721-2004)、鉻標(biāo)準(zhǔn)液(批號(hào)：GSB 04-1723-2004(a))、銻標(biāo)準(zhǔn)液(批號(hào)：GSB 04-1735-2004(a))、銅標(biāo)準(zhǔn)液(批號(hào)：GSB 04-1725-2004)均購(gòu)于國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；鉛標(biāo)準(zhǔn)液(批號(hào)：211035050)、汞標(biāo)準(zhǔn)液(批號(hào)：212075009)購(gòu)于美國(guó)Accu Standard公司；砷標(biāo)準(zhǔn)液(批號(hào)：00009335632)購(gòu)于美國(guó)Agilent Technologies公司。以上7種元素標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)值均為1000 μg /mL。鹽酸、過氧化氫溶液均為分析純?cè)噭?成都市科隆化學(xué)品有限公司)，硝酸溶液為優(yōu)級(jí)純?cè)噭?天津市科密歐試劑公司)，正己烷(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜級(jí))，無水乙醚(四川西隴化工有限公司)，無水硫酸鈉(成都金山化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器 BSA224S精密電子天平(Sartorius)，TGL-16可控調(diào)溫電爐(四川蜀科儀器有限公司)，EG37A plus微控?cái)?shù)顯電熱板(Lab Tech)，BHW-09A型消解儀(上海博通化學(xué)科技有限公司)，微波消解儀(Anton Paar)，Optima 8000電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜儀(Perkin Elmer)Agilent 7890B-5977A氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó))，AL140電子天平(瑞士Metter Toledo公司)，揮發(fā)油蒸餾裝置。

2 含量測(cè)定

2.1 供試品的制備 以微波消解法前處理京墨樣品。差減法精密稱取JM1樣品粉末0.3000 g于聚四氟乙烯消解管中，加入硝酸-30 %過氧化氫(體積比為4∶1)的混合酸5 mL，放入消解儀中于120 ℃預(yù)消解2 h。取出后補(bǔ)加2 mL硝酸，移入密封罐中置于微波消解系統(tǒng)中按照程序進(jìn)行消解。消解完畢后，以超純水轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容并過濾，所得濾液即為供試品溶液。同法制備試劑空白溶液。微波消解系統(tǒng)程序見表1。

表1 微波消解程序

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢出限 以1 %硝酸溶液系列稀釋配制相應(yīng)濃度的砷、鉻、銻、鎘、鉛、銅的混合標(biāo)準(zhǔn)液；以1 %硝酸溶液系列稀釋配制汞的單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)液。對(duì)試劑空白進(jìn)行11次測(cè)定[11]，以待測(cè)元素響應(yīng)值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，即可得該元素的方法檢出限。各標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線、R2值及檢出限。結(jié)果見表2。

表2 各元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)及檢出限

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取JM1樣品的供試品溶液分別連續(xù)測(cè)定6次。測(cè)定各元素RSD范圍均在1.42 %～ 2.66 %之間。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取JM1樣品，平行6份，按“2.1”項(xiàng)下的前處理方法進(jìn)行樣品消解，得到6份供試液。測(cè)定各元素RSD范圍均在1.27 %～ 4.11 %之間。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取JM1樣品的微波供試品溶液，每隔4 h測(cè)定一次共測(cè)6次。測(cè)得溶液中各RSD范圍均在0.96 %～ 4.91 %之間。表明該消解方法所得的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 對(duì)已知含量的JM1京墨樣品作加樣回收試驗(yàn)。按“2.1”項(xiàng)下的前處理方法進(jìn)行樣品消解，得到6份供試液作回收率試驗(yàn)。由表3可得微波消解測(cè)定7種元素的回收率在86.70 %～104.37 %之間，RSD≤4.87 %。表明該方法均準(zhǔn)確可靠。

表3 微波消解回收率測(cè)定結(jié)果 (n=6)

注：“-”表示低于檢出限，未檢出。

2.3 樣品測(cè)定 精密稱取7批次的京墨樣品，按“2.1”項(xiàng)下兩種方法制備供試品溶液，平行3次。以ICP-AES法測(cè)Sb、As、Pb、Cr、Cd和Cu元素的含量，以原子熒光光度法測(cè)Hg元素含量。其中7個(gè)樣品所得供試品溶液中As元素均低于檢測(cè)限，未被檢出。其余重金屬含量測(cè)定結(jié)果見表4。

以項(xiàng)目超標(biāo)率=項(xiàng)目超標(biāo)數(shù)/項(xiàng)目總數(shù)×100 %，比較所測(cè)不同廠家不同批號(hào)京墨藥材的7種有害元素情況[12]。所測(cè)京墨藥材重金屬超標(biāo)率為As:0 %，Pb:71.43 %，Cr:100 %，Cd:0%，Sb:100 %，Cu:71.43 %，Hg:0 %。因京墨藥材不同廠家間及同廠家不同批號(hào)間存在沒有規(guī)律的差異，推測(cè)可能為原材料引入了重金屬，也可能是生產(chǎn)、運(yùn)輸過程中引入污染。

根據(jù)《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[13]中規(guī)定鉛(Pb)≤5.0 mg/kg、鎘(Cd)≤0.3 mg/kg、汞(Hg)≤0.2 mg/kg、銅(Cu)≤20.0 mg/kg、砷(As)≤2.0 mg/kg，可知京墨中Pb和Cu存在超標(biāo)現(xiàn)象。各種相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中缺少對(duì)中藥材重金屬Cr及Sb的限量要求。因此參考《食品中污染物限量》[14]中最大限量規(guī)定鉻(Cr)≤2 mg/kg，可知Cr約超過限量指標(biāo)145倍，超標(biāo)現(xiàn)象尤為嚴(yán)重。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定每人每天可以耐受的Sb攝入量(TDI)為6.00 μg/ kg[15]，因此京墨每日攝入量的參考值為0.0019 μg，少于實(shí)際用量，可見京墨藥材中Sb也存在超標(biāo)現(xiàn)象。但由于樣品來源不同，而且藥品相較于食品的攝入量也存在較大差異，因此其限量的指標(biāo)限定還需進(jìn)一步研究探討。

表4 微波消解-ICP-AES法測(cè)得京墨重金屬含量結(jié)果 (n= 3)

3 揮發(fā)油GC-MS定性分析

3.1 實(shí)驗(yàn)參數(shù)及分析條件 載氣為氦氣，純度99.995 %，分流比為2∶1。升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，維持3 min，以5 ℃/min的升溫速率升至120 ℃，維持10 min。再以5 ℃/min的升溫速率升至220 ℃，維持15 min。進(jìn)樣量1 μL，溶劑延遲4 min。進(jìn)樣口溫度280 ℃，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃。電離方式為EI；電子能量70 eV，電子倍增1.3 kV。MS采集模式為掃描。質(zhì)量掃描范圍在33～500 amu間。譜庫(kù)為NIST 11.L，匹配度大于80%的質(zhì)譜圖并且排前3 位的均為同一種物質(zhì)或同分異構(gòu)體的，則可定性為該種物質(zhì)，小于80%的認(rèn)為不能確定。

3.2 供試液溶液制備 將京墨樣品粉末過二號(hào)篩。差減法精密稱取京墨粉末3 g，放在500 mL燒瓶中，加水300 mL與玻璃珠數(shù)粒，振搖混合。按《中國(guó)藥典》2015版第四部通則2204中的揮發(fā)油測(cè)定法的甲法，水蒸氣蒸餾5 h至收集器中油量不再增加后停止加熱后放置1 h。用乙醚將揮發(fā)油從測(cè)定裝置中轉(zhuǎn)移出來，加入無水硫酸鈉除去殘余水分，0.45 μm微孔濾膜過濾后，得到具有特殊香味的油狀物，備用。

3.3 結(jié)果及分析 對(duì)比7個(gè)樣品的總離子流色譜圖可得，所有樣品的峰均可在JM3樣品色譜圖中找到，因此該批次樣品具有代表性，以其為研究對(duì)象進(jìn)行分析。JM3京墨樣品揮發(fā)油GC-MS總離子流色譜圖見圖1。由儀器工作站數(shù)據(jù)庫(kù)NIST 11.L自動(dòng)生成的鑒定數(shù)據(jù)可見表5，7個(gè)主要色譜峰所代表的化合物均為多環(huán)芳烴，這7個(gè)化合物的毒性數(shù)據(jù)如表5所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果及毒性數(shù)據(jù)分析可得京墨揮發(fā)油主要成分包括Acenaphthylene、Fluorene、Phenanthrene、4H-Cyclopenta(def)phenanthrene、Fluoranthene、Pyrene等7 個(gè)化合物，其中Acenaphthylene為擬副交感神經(jīng)系統(tǒng)藥，其余6 種具有致癌性及致畸性。

表5 JM3批次樣品揮發(fā)油GC-MS總離子流色譜圖分析結(jié)果及其揮發(fā)油中多環(huán)芳烴成分的毒性數(shù)據(jù)

4 討論

實(shí)驗(yàn)以微波消解前處理結(jié)合ICP-AES對(duì)京墨7種有害元素進(jìn)行含量測(cè)定。微波消解具有自動(dòng)化程度高、試劑用量少、可實(shí)現(xiàn)無人看守等優(yōu)點(diǎn)，且其操作環(huán)境密閉，元素?fù)]發(fā)損失較少，有效避免了因操作與外界接觸而增加樣品污染可能性的問題[16-17]。檢測(cè)結(jié)果表明京墨藥材中鉛、銅、鉻、銻及重金屬總量存在超標(biāo)現(xiàn)象，應(yīng)規(guī)范其臨床使用劑量。

實(shí)驗(yàn)還對(duì)京墨中的揮發(fā)油化學(xué)成分的組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明京墨揮發(fā)油中7個(gè)主要化學(xué)成分均為多芳烴，推測(cè)是在制備墨粉原料的過程中植物高溫缺氧條件下不完全燃燒的產(chǎn)物，或者是植物本身含有的成分[18-19]，這些化合物均具有致癌性、致畸性。綜合京墨中重金屬含量及揮發(fā)油組成的毒性數(shù)據(jù)文獻(xiàn)，建議對(duì)其用藥入方謹(jǐn)慎對(duì)待。