葡萄疏果多酚類含量及體外抗氧化活性研究

范祺，楊立風，張明，王崇隊，張博華，馬超

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

我國是葡萄的生產和出口大國，2017年中國的葡萄種植面積約80萬hm2，總產量比上年增加了40萬t，達到了1120萬t[1]。葡萄座果率高，需要進行疏果，隨著我國葡萄產業(yè)的迅速發(fā)展，每年因疏果產生大量的廢棄物，這些廢棄物直接棄置，不僅造成了資源浪費，還污染了環(huán)境。

葡萄含有一系列對人體健康有利的成分，葡葡多酚是其中重要的活性成分。葡萄多酚是一種植物多酚類活性物質，是葡萄次生代謝產物中的重要組成部分，葡萄中較重要的多酚類物質為黃酮型多酚類，包括多酚、兒茶素、黃酮、黃酮醇、黃烷醇、黃酮單寧、查耳酮以及花色苷等[2]。作為一種天然抗氧化劑，葡萄多酚已廣泛應用于醫(yī)療保健、食品加工等領域，開發(fā)利用葡萄多酚具有重要的現(xiàn)實意義[3]。隨著農業(yè)循環(huán)經濟和葡萄酒產業(yè)可持續(xù)發(fā)展觀點的提出，近年來從葡萄園農業(yè)廢棄物和葡萄工業(yè)廢棄物中提取葡萄多酚成為研究重點，葡萄多酚具有很強的抗氧化作用[4]，且其抗氧化活性因葡萄的成熟度、品種、所在部位和生長環(huán)境等因素的不同而有所區(qū)別。目前葡萄多酚可以利用葡萄葉、根、枝條等部位進行工業(yè)化生產，但是對于葡萄疏果的開發(fā)利用研究基本為零。因此針對疏果天然活性成分的開發(fā)利用，對于實現(xiàn)廢棄物的再利用和環(huán)境保護都有積極的意義[5]。本研究以13個不同品種的葡萄疏果為研究對象，分析了疏果中多酚和黃酮含量，并對其抗氧化活性進行測定分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

13個品種的葡萄來自于濟南章丘附近的葡萄園，分別為溫可、A17、夏黑、騰稔、紅巴拉多、維多利亞、紅寶石、火焰無核、摩爾多瓦、金手指、玫瑰香、陽光玫瑰、巨峰。樣品采集于8月上旬，隨機選取成熟度相似且大小一致的疏果，每個品種采集1～2 kg。

Folin-Ciocalteu試劑、碳酸鈉、蘆丁、DPPH、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、水楊酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、雙氧水、鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸鹽、甲醇、乙醇等，均為分析純級別。

1.2 儀器與設備

ME104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器，江蘇杰瑞爾電器有限公司；UV1000紫外分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；RE-501旋轉蒸發(fā)儀，上海越眾儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

準確稱取不同品種的葡萄疏果2～3 g，精確到小數(shù)點后四位，置于 50 mL 提取管中，按 1：10（M：V）加入 50%無水乙醇，經剪切機剪切破碎3 min，在70℃條件下水浴提取1 h后經抽濾收集濾液，濾液轉入50 mL容量瓶中，定容至刻度，待測。

1.3.2 總多酚含量的測定

（1）標準液的配制

準確稱取沒食子酸0.0250 g，用蒸餾水溶解并定容到1000 mL，得到濃度為0.025 mg/mL的標準儲備液[6]。

（2）標準曲線的建立

準確吸取 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL的沒食子酸標準儲備液置于25 mL的棕色容量瓶中，分別加入福林酚試劑1.0 mL，混勻，5 min后加入1 mL、10%的Na2CO3溶液，充分混合后定容，30℃避光放置30 min，以不加標準液的溶液為空白對照，在760 nm波長下測定吸光值，每個樣品平行測定3次。以沒食子酸在反應體系中的質量濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

（3）總多酚含量的測定

多酚的含量測定參照賈榮等[7]的方法。將0.1 mL提取液加入到1 mL蒸餾水的試管中，振蕩后加入1 mL福林酚試劑，混勻，5 min后加入1 mL、10%的Na2CO3溶液，充分混勻，在30℃黑暗處反應30 min，在760 nm波長處測定吸光度。

1.3.3 總黃酮含量的測定

（1）總黃酮含量測定

將0.5 mL提取液加入試管，并用60%的乙醇溶液補充至2.5 mL，加入5%的NaNO2溶液0.15 mL，搖勻，室溫放置6 min后，加入10%的Al(NO3)3溶液0.15 mL，搖勻，室溫放置6 min，加入1 mol/L的NaOH溶液2 mL，室溫放置20 min，于510 nm處測定吸光值。

（2）蘆丁標準曲線繪制

參考夏光輝等[8]采用硝酸鋁顯色法繪制蘆丁標準曲線。稱取蘆丁5.1 mg，用乙醇定容至50 mL，準確吸取標準應用液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于容量瓶中，加50%乙醇至5 mL，加 5%NaNO2溶液0.15 mL，搖勻，放置6 min，分別加10%Al(NO3)3溶液0.15 mL，搖勻，放置6 min，加 1 mol/L NaOH 溶液 2 mL，放置 15 min，于 510 nm波長處測定吸光度。

1.3.4 體外抗氧化活性的測定

（1）對DPPH自由基清除能力

各待測樣品適當稀釋后用移液槍取1 mL，加入1 mL、0.4 mmol/L DPPH的甲醇溶液，混合均勻，加入2 mL水，30℃水浴30 min，在517 nm處測定吸光值。同時以1 mL、DPPH+1 mL甲醇溶液混合后的吸光值為空白組[9]。

（2）對羥自由基清除能力

測定方法參照曾軍等[10]的方法，量取1.8 mmol/L的FeSO42 mL放入試管中，加入1.8 mmol/L水楊酸1.5 mL，加入不同濃度樣品溶液1 mL，最后加入0.03%H2O20.1 mL并啟動整個反應，37℃反應30 min后，2000 r/min離心10 min，以蒸餾水代替樣品溶液做空白參比，在510 nm測定吸光值。

（3）還原力測定

參照齊巖等[11]的測定方法，取不同量待測液加去離子水補足至1 mL，加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和1%的鐵氰化鉀溶液各2 mL，混合均勻，50℃保溫20 min，放至室溫，加入2 mL 10%三氯乙酸，混合均勻，靜置10 min。取混合液2 mL，加2 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3，混合均勻，放置10 min，在700 nm下測定吸光度。同時以去離子水代替樣品做空白對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個試驗重復3次，數(shù)據(jù)采用Origin 9.0作圖，并用SPSS 20.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

圖1為沒食子酸標準曲線，在760 nm波長處測定吸光度，所得標準曲線方程為y=0.0409x+0.0543相關細數(shù)R2=0.9996，線性關系良好，可以此來計算葡萄疏果中的多酚含量。

圖2為蘆丁標準曲線，線性回歸方程為y=6.6982x＋0.0048，相關系數(shù)R2=0.9999，線性關系良好，可以由此回歸方程計算葡萄疏果中黃酮的含量。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Standard curve of rutin

2.2 多酚含量的比較

圖3 不同品種葡萄疏果多酚含量Fig.3 Contents of polyphenols in various kinds of grape prethins

圖3為不同品種葡萄疏果多酚含量，由圖3可知，13個不同品種葡萄疏果總多酚含量有較大的差異，變化范圍為2.87～8.21 mg/g，13種葡萄疏果多酚含量大小的順序為：摩爾多瓦>A17>溫可>紅巴拉多>金手指>玫瑰香>藤稔>陽光玫瑰>維多利亞>火焰無核>紅寶石>巨峰>夏黑。含量最高的為摩爾多瓦，最低的為夏黑，盧靜等[12]測定了葡萄果渣中多酚提取量為3.39 mg/g，姜黎等[5]提取的葡萄皮渣中多酚含量達17.79 mg/g，與其相比葡萄疏果中多酚含量處于中游水平，可以作為葡萄多酚的提取原料。

2.3 黃酮含量的比較

圖4為不同品種葡萄疏果黃酮含量，黃酮的含量在6.0～17.9 mg/g范圍內變化，含量最多的為摩爾多瓦，最少的為夏黑。13種葡萄疏果多酚含量大小的順序為：摩爾多瓦>A17>溫可>金手指>紅巴拉多>維多利亞>藤稔>玫瑰香>火焰無核>陽光玫瑰>巨峰>紅寶石>夏黑。

圖4 不同品種葡萄疏果黃酮含量Fig.4 Contents of flavones in various kinds of grape prethins

綜合圖3、4可以看出，多酚含量多的品種其黃酮含量也相對較多，多酚含量最多的品種為摩爾多瓦，其黃酮含量也最高；多酚含量最少的為品種為夏黑，其黃酮含量也最少。

2.4 抗氧化性比較

2.4.1 DPPH自由基清除能力比較

如圖5所示，半數(shù)清除率IC50反映了被測樣品的抗氧化能力，數(shù)值越小，樣品的抗氧化能力越強。由圖可以看出，不同品種葡萄之間DPPH自由基清除能力相差較大，其中清除能力最強的是摩爾多瓦，IC50為28.04 μg/mL；清除能力最差的品種為夏黑，為 375 μg/mL。溫可、騰稔、紅巴拉多、玫瑰香和陽光玫瑰清除能力相近，紅寶石、火焰無核和巨峰三個品種之間的清除能力相近。

圖5 不同品種葡萄疏果多酚對DPPH自由基的半數(shù)清除率Fig.5 IC50of scavenging DPPH of various kinds of grape prethins polyphenols

2.4.2 羥自由基清除能力

羥自由基清除試驗結果見圖6，由圖可以看出，不同葡萄品種的羥自由基清除能力相差較大，清除能力較強的為摩爾多瓦、A17和玫瑰香，IC50值分別為 248、442、459.8 μg/mL；羥自由基清除能力較弱的為巨峰和火焰無核，IC50值分別為 1881 μg/mL和1500 μg/mL。

圖6 不同品種葡萄疏果羥自由基清除能力測定Fig.6 Hydroxy radical scavenging capacities of various kinds of grape prethins polyphenols

2.4.3 還原力比較

圖7（見下頁）為不同品種葡萄疏果還原力測定，由圖7可以看出，13種樣品的吸光值隨著濃度的不斷增大而穩(wěn)步升高，且具有一定的線性關系。說明13種樣品的總還原能力與樣品濃度具有劑量關系。斜率越大，還原能力越強，其中還原力最強的是摩爾多瓦和A17兩個品種，還原力最弱的為夏黑。

圖7 不同品種葡萄疏果還原力測定Fig.7 Reducing capacities of various kinds of grape prethins polyphenols

3 結論

13種葡萄疏果中多酚與黃酮含量相差較大，多酚和黃酮含量最高的品種均為摩爾多瓦，含量分別為8.21 mg/g和17.9 mg/g。含量最少的品種為夏黑，含量分別為2.87 mg/g和6.0 mg/g。摩爾多瓦、A17、溫可和玫瑰香品種的多酚、黃酮含量較高，抗氧化活性比較高，可作為葡萄多酚的提取來源；夏黑與紅寶石兩個品種的多酚、黃酮含量較少，抗氧化活性也比較低。