喉癌患者腫瘤組織中PINCH1表達(dá)水平與患者臨床預(yù)后的關(guān)系

岳艷 劉勇 劉莉萍 金光裕

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 咸陽(yáng) 712000；2.陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科 咸陽(yáng) 712000)

喉癌是上呼吸道最常見的惡性腫瘤之一，85%～95%為鱗狀細(xì)胞癌[1]。喉癌患者的5年生存率約為60%，盡管在診斷和治療方面取得了進(jìn)展，但其生存率及死亡率并無顯著改善[2]。癌細(xì)胞侵襲、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者手術(shù)失敗及死亡的重要原因[3]。因此，識(shí)別及研究喉癌發(fā)生、進(jìn)展過程中新的分子標(biāo)志物對(duì)于提高喉癌患者的臨床預(yù)后具有重要意義。PINCH1(particulary interesting new cysteine-histicline rich protein-1)是一種廣泛表達(dá)于肺、心臟、子宮等組織的整合素鏈接激酶(intergrin-linked kinase， ILK)家族黏著斑蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與增殖、細(xì)胞遷移、ILK水平及功能的作用[4]。有研究[5-7]指出，PINCH1與肝癌、非小細(xì)胞肺癌、垂體腺瘤等腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)。然而，缺乏相關(guān)腫瘤組織中PINCH1表達(dá)水平對(duì)喉癌患者臨床預(yù)后影響的研究報(bào)道。本研究收集86例喉癌患者的臨床資料，探討腫瘤組織中PINCH1表達(dá)水平與臨床病理特征及5年總生存率的關(guān)系，為喉癌患者臨床治療提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 選擇2009年1月～2013年12月在陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受治療的86例喉癌患者作為研究對(duì)象。根據(jù)喉癌組織中PINCH1表達(dá)水平將患者分為PINCH1陽(yáng)性表達(dá)組(n=45)和PINCH1陰性表達(dá)組(n=41)。在不影響喉腔重建黏膜處，取同一患者癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣<10 mm)作為對(duì)照(n=86)。所有手術(shù)標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)病理確診。入組患者男性48例、女性38例；年齡45～83歲，平均(64.15±18.64)歲；有吸煙史33例、嗜酒史22例；行喉垂直部分切除術(shù)21例、喉水平部分切除術(shù)25例、喉全切除術(shù)40例。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有研究對(duì)象均知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)對(duì)喉癌標(biāo)本進(jìn)行TNM分期[8]；術(shù)前未接受放化療，Ⅰ期患者若術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)，接受全身化療，Ⅱ～Ⅳ期患者術(shù)后接受至少2個(gè)周期含鉑方案兩藥聯(lián)合放療或化療；術(shù)后病理證實(shí)為喉癌或癌旁正常組織；無其他臟器嚴(yán)重疾??；由患者或直系親屬知情同意并簽署手術(shù)知情同意書，提供患者的詳細(xì)資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有心、肝、脾、肺、腎等重要臟器損傷；合并其他惡性腫瘤；合并呼吸系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病；精神疾病及言語(yǔ)功能障礙；隨訪資料不全；未簽署手術(shù)治療知情同意書。

1.2 方法 詳細(xì)記錄入組患者性別、年齡、吸煙史、嗜酒史、臨床分期、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤部位等臨床病理特征。吸煙史的定義是平均≥10支/d，持續(xù)10年以上；嗜酒史的定義是飲酒史5年以上，男性酒精攝入量>40 g/d，女性酒精攝入量>20 g/d。

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PINCH1在喉癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋并利用切片機(jī)(徠卡，RM2235，德國(guó))切片。60 ℃烘片后，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，檸檬酸緩沖液高壓修復(fù)抗原，3%過氧化氫溶液封閉后滴加PINCH1一抗與二抗(Santa Cruz公司，sc-393133，美國(guó))，二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。按照試劑說明書(BF06099-500，北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司)進(jìn)行操作。所有切片均采用雙盲法由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片，在高倍鏡視野下(×400)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。

免疫組化法結(jié)果判定：染色強(qiáng)度積分按不染色0分、淺黃色1分、黃色2分、棕黃色3分計(jì)算，記0～1分為PINCH1陰性表達(dá)，2～3分為PINCH1陽(yáng)性表達(dá)；染色面積積分按染色細(xì)胞數(shù)占所有細(xì)胞數(shù)<5%記0分、5%～25%記1分、26%～50%記2分、51%～75%記3分、>75%記4分計(jì)算，記0分為PINCH1陰性表達(dá)，1～4分為PINCH1陽(yáng)性表達(dá)[9]。

1.3 隨訪 患者術(shù)后每隔3～6個(gè)月復(fù)查1次CT、喉鏡、B超或MRI，根據(jù)復(fù)查結(jié)果診斷是否復(fù)發(fā)，必要時(shí)行手術(shù)確診。臨床醫(yī)師結(jié)合本院門診復(fù)查病例資料及電話進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間61～81個(gè)月，平均(71.44±10.15)個(gè)月，隨訪至患者死亡或2018年4月1日。其中，總生存率為從入院時(shí)至因任何原因引起死亡的患者例數(shù)占全部人數(shù)的比例。

2 結(jié)果

2.1 PINCH1在喉癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)(圖1) PINCH1在喉癌組織細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中表達(dá)，染色呈淺黃色、黃色及棕黃色。PINCH1在喉癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為52.33%(45/86)，顯著高于癌旁正常組織陽(yáng)性表達(dá)率8.14%(7/86，P<0.05)。

圖1. PINCH1在喉癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)(×400) A.PINCH1在癌旁正常組織中的表達(dá)；B.PINCH1在喉癌組織中低表達(dá)；C.PINCH1在喉癌組織中高表達(dá)

2.2 腫瘤組織中PINCH1表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系 PINCH1在喉癌患者腫瘤組織中的表達(dá)水平與性別、吸煙史、嗜酒史、分化程度、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)，與年齡、臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05，表1)。

表1 腫瘤組織中PINCH1表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 腫瘤組織中PINCH1表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 PINCH1陽(yáng)性表達(dá)的喉癌患者5年中位生存時(shí)間為28個(gè)月，5年生存率為22.22%(10/45)；PINCH1陰性表達(dá)的喉癌患者5年中位生存時(shí)間為53個(gè)月，5年生存率為65.85%(27/41)。Log-rank法比較顯示，PINCH1陽(yáng)性表達(dá)的喉癌患者5年總生存率顯著低于PINCH1陰性表達(dá)的喉癌患者(P<0.05，圖2)。

2.4 影響喉癌患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析 將患者的年齡、臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及PINCH1表達(dá)水平作為自變量，將患者5年隨訪時(shí)間作為因變量，建立Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析。結(jié)果顯示，臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、T分期(T3～T4期)、PINCH1表達(dá)水平(陽(yáng)性)是影響喉癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05，表2)。

圖2. 腫瘤組織中PINCH1表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

雖然喉癌發(fā)病率較低，但病情惡性程度高，患者預(yù)后差。本研究中喉癌患者的5年生存率為43.02%(37/86)，低于既往研究報(bào)道[2]，或許是由于本研究入組患者中Ⅲ～Ⅳ期、高分化、T3～T4期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例較大，患者機(jī)體條件偏差，臨床病例資料差異導(dǎo)致。喉癌發(fā)病原因可能與吸煙、飲酒、空氣污染、職業(yè)因素、病毒感染、性激素、微量元素缺乏、放射線等多種致癌因素有關(guān)[10-11]。然而，喉癌的確切發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚。近幾年，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展和臨床診斷水平的提高，許多分子標(biāo)志物的出現(xiàn)對(duì)于喉癌診治及預(yù)后提供了新的參考。

表2 影響喉癌患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

PINCH1屬于ILK家族成員，最初作為衰老紅細(xì)胞的重要標(biāo)志物被大量研究[12]。PINCH1在胚胎發(fā)育整個(gè)過程及包括膀胱、肺、子宮、心臟等器官在內(nèi)均有表達(dá)[13-14]。PINCH1可通過ILK結(jié)構(gòu)域的雙鋅指結(jié)構(gòu)與整合素連接酶N端的ANK重復(fù)序列結(jié)合，而整合素連接酶的C端則與整合素的胞質(zhì)域結(jié)合，所構(gòu)成的PINCH1-整合素連接酶N端/C端蛋白網(wǎng)絡(luò)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相連，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附及信號(hào)傳導(dǎo)，并參與對(duì)細(xì)胞增殖、活動(dòng)、分化及遷移等行為的調(diào)節(jié)。此外，PINCH1還可與受體酪氨酸激酶結(jié)合蛋白結(jié)合參與生長(zhǎng)因子信號(hào)的傳導(dǎo)途徑。有研究[15-16]表明，PINCH1與一些人類腫瘤、糖尿病腎病等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而，PINCH1在喉癌中的作用機(jī)制仍然未知。本研究發(fā)現(xiàn)，PINCH1在喉癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織的陽(yáng)性表達(dá)率，且PINCH1表達(dá)水平與年齡、臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示PINCH1可能參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PINCH1陽(yáng)性表達(dá)的喉癌患者5年總生存率顯著低于PINCH1陰性表達(dá)的喉癌患者，且PINCH1表達(dá)水平(陽(yáng)性)是影響喉癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。研究結(jié)果提示，PINCH1表達(dá)水平與喉癌患者臨床預(yù)后密切相關(guān)。本研究或許提示PINCH1有望成為治療喉癌的潛在靶點(diǎn)，且為以PINCH1為靶點(diǎn)研發(fā)治療喉癌的分子靶向藥物提供理論依據(jù)。本研究與Tsinias等[17]的研究結(jié)果一致，均指出腫瘤組織中PINCH1表達(dá)水平預(yù)測(cè)喉癌患者預(yù)后的重要價(jià)值，但機(jī)制還需進(jìn)一步探討。本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床分期、T分期與喉癌患者預(yù)后密切相關(guān)，與既往研究結(jié)果一致[18]。

本研究存在以下局限性：?jiǎn)沃行难芯?，樣本量較少，制約本研究結(jié)論的準(zhǔn)確性；回顧性研究，容易造成選擇偏倚；喉癌組織標(biāo)本獲取時(shí)間不一致造成組織中PINCH1檢測(cè)時(shí)間不一致，或許對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響?？傊[瘤組織中PINCH1表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)喉癌患者預(yù)后的指標(biāo)。后期研究應(yīng)根據(jù)PINCH1在腫瘤組織細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核表達(dá)差異，分類別對(duì)喉癌患者預(yù)后進(jìn)行研究。