毛葡萄及釀酒皮渣中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量分析

張 勁，黃小云，謝太理，楊 瑩，管敬喜，謝林君，成 果

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007）

毛葡萄及釀酒皮渣中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量分析

張 勁，黃小云，謝太理，楊 瑩，管敬喜，謝林君，成 果

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007）

探索廣西野生毛葡萄中功能成分白藜蘆醇含量分布，采用高效液相色譜法(HPLC)對毛葡萄果皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒及釀酒葡萄皮渣、釀酒葡萄籽中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量進行測定。結果表明，除葡萄汁外，毛葡萄、葡萄酒及釀酒皮渣中均存在不同含量的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷，且相同部位白藜蘆醇苷含量均高于白藜蘆醇。釀酒皮渣中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的含量最高，具備工業(yè)化提取的經(jīng)濟價值，為毛葡萄釀酒廢棄物的綜合利用提供了理論依據(jù)。

白藜蘆醇； 白藜蘆醇苷； 毛葡萄； 釀酒皮渣

白藜蘆醇（resveratrol，Res）別名芪三酚，化學名為3,4',5-三羥基二苯乙烯，分子式C14H12O3，它是植物體在惡劣環(huán)境中或受到病原體侵害時分泌的抗毒素，屬于天然活性多酚類物質[1]。白藜蘆醇具有抗菌、抗脂質氧化、抗癌、抗血小板凝聚與血管松弛、降低血脂等多種重要的作用，被喻為紫杉醇之后又一綠色抗癌物質[2-3]，在保健食品和醫(yī)藥領域中具有可觀的開發(fā)前景。白藜蘆醇分子中的羥基與葡萄糖結合而形成白藜蘆醇苷（Piceid，Pd），又稱虎杖苷，白藜蘆醇苷和白藜蘆醇具有相似的生物活性，在腸道中糖苷酶的作用下分離出白藜蘆醇[4-6]。近年來，白藜蘆醇在含量分析、工藝提取、藥理作用等方面的研究較為廣泛[7-9]，而白藜蘆醇苷相關研究較少受關注。目前研究發(fā)現(xiàn)，葡萄是含有較多白藜蘆醇的植物之一，但不同品種的葡萄或同種葡萄不同部位中所含白藜蘆醇的含量差異較大，一般釀酒品種葡萄白藜蘆醇的含量高于鮮食品種葡萄[10]，葡萄皮中白藜蘆醇的含量較高[11]，葡萄籽、葡萄果穗軸、葡萄葉、葡萄果汁、葡萄酒中也發(fā)現(xiàn)不同程度的白藜蘆醇[12]。

毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd）屬于葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis.L）真葡萄亞屬（E-uvitis）東亞種群之一，原產(chǎn)于中國，是廣西野生葡萄中分布最廣、蘊藏量最大的種類[13]。前人研究發(fā)現(xiàn)毛葡萄及其干紅葡萄酒中總酚、總類黃酮、總花色苷的含量高于歐亞種赤霞珠葡萄與葡萄酒，有較強的清除自由基及銅原子還原能力[14]，中國野生種11個種或36個變種株系漿果葡萄中白藜蘆醇含量最高為毛葡萄[15]。葡萄廢棄物中白藜蘆醇的研究越來越多[16-18]，關于毛葡萄釀酒皮渣中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的研究少有報道。本實驗探索了白藜蘆醇和白藜蘆醇苷在毛葡萄中的分布情況，探索利用毛葡萄釀酒皮渣提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

毛葡萄：野生，品種為“野釀2號”，由廣西農(nóng)業(yè)科學院生物研究所鑒定，2016年8月采自廣西羅城。

毛葡萄及釀酒皮渣：由廣西農(nóng)業(yè)科學院葡萄與葡萄酒研究所釀造工藝研究室利用野釀2號毛葡萄按照干紅釀造工藝發(fā)酵釀造干紅葡萄酒，在酒精發(fā)酵結束時分離釀酒皮渣（含葡萄籽）。

毛葡萄鮮樣：稱取1 kg鮮果，分離出果皮、果籽。果肉經(jīng)勻漿、離心（8000 r/min，10 min），取上清液備用。果皮和果籽分別加液氮粉碎，冷凍干燥（-58℃，24 h）。葡萄皮和葡萄籽干粉備用。

毛葡萄釀酒皮渣：稱取1 kg釀酒皮渣，分離出葡萄皮渣與葡萄籽，經(jīng)60℃熱風烘干，粉碎，干粉備用。

試劑：白藜蘆醇、白藜蘆醇苷（HPLC），Sigma；乙腈（色譜級），F(xiàn)isher；乙酸乙酯，（分析純）；甲醇（色譜級），F(xiàn)isher；水為實驗室超純水。

儀器設備：高效液相色譜儀（LC-20AT），日本島津；高速離心機（TG16-WS），湖南湘儀；真空冷凍干燥機（Alpha 1-2LDplus），德國Christ；超聲波清洗機（XUB25），Grant；電熱鼓風干燥箱，上海躍進；旋轉蒸發(fā)儀（RE-52AA），上海亞榮。

1.2 實驗方法

1.2.1 白藜蘆醇、白藜蘆醇苷的提取

葡萄皮、葡萄籽樣品：準確稱取經(jīng)干燥粉碎后的葡萄鮮果分離的葡萄皮、葡萄籽及釀后葡萄皮渣和葡萄籽各1.0000 g，加入10 mL乙酸乙酯，混勻，超聲30 min，4℃冰箱中放置48 h，離心取上清液，40℃真空濃縮至干，殘留物用甲醇溶解后定容至5 mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液上機進行HPLC分析。

葡萄汁、葡萄酒樣品：離心后的澄清葡萄汁樣品及葡萄酒樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液上機進行HPLC分析。

1.2.2 HPLC分析

色譜條件：島津InertSustainC18(250mm×4.6mm×5 μm)，流動相：乙腈∶水=40∶60（v/v），檢測器：UV檢測器，流速：0.60 mL/min，波長306 nm,柱溫：30℃，進樣量：10μL。

標準曲線繪制：準確稱取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷標準品適量，用甲醇配制成0.94 mg/mL的白藜蘆醇標準母液和0.79 mg/mL的白藜蘆醇苷標準母液。取母液，用甲醇配制系列濃度白藜蘆醇和白藜蘆醇苷混合對照溶液，其中白藜蘆醇對照液濃度為0.0094μg/mL、0.047μg/mL、0.094μg/mL、0.47 μg/mL、0.94 μg/mL、4.7 μg/mL、9.4 μg/mL、18.8μg/mL，白藜蘆醇苷對照液濃度為0.079μg/mL、0.158 μg/mL、0.79 μg/mL、3.95 μg/mL、7.9 μg/mL、19.75μg/mL、39.5μg/mL、79μg/mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10μL在上述的色譜條件下上機進行HPLC分析。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇、白藜蘆醇苷線性關系的考察

經(jīng)HPLC分析，白藜蘆醇苷標準品在5.383 min出峰，白藜蘆醇標準品在9.204 min時出峰，色譜圖見圖1。以標準品濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，見圖2、圖3，標準曲線為：白藜蘆醇，Y=146165X+6301.7（μg/mL），R2=0.9999；白藜蘆醇苷，Y=61439X+5967.8（μg/mL），R2=0.9998，線性關系良好。

圖1 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷標準品HPLC色譜圖

圖2 白藜蘆醇標準曲線

圖3 白藜蘆醇苷標準曲線

2.2 白藜蘆醇和白藜蘆醇苷測定結果

根據(jù)HPLC分析結果，樣品HPLC色譜圖見圖4，樣品中白藜蘆醇苷出峰時間為5.4 min左右，白藜蘆醇出峰時間為9.2 min左右。根據(jù)出峰時間和峰面積用標準曲線計算出各樣品中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，數(shù)據(jù)結果見表1、表2。

圖4 毛葡萄釀酒葡萄皮HPLC色譜圖

表1 毛葡萄皮、籽中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷含量

表2 毛葡萄酒、汁中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷含量

結果表明，除葡萄汁外，葡萄酒、葡萄鮮果中葡萄皮、葡萄籽以及釀酒葡萄皮渣、釀酒葡萄籽中均含有白藜蘆醇和白藜蘆醇苷；毛葡萄酒中存在白藜蘆醇和白藜蘆醇苷，而葡萄汁中未檢出，說明葡萄皮、籽中白藜蘆醇及其苷可以通過發(fā)酵浸漬轉移到葡萄酒中。根據(jù)陳雷等[19]的研究，對市售國產(chǎn)的11種紅、白葡萄中白藜蘆醇進行含量測定，其含量為1.0～92.0μg/100 mL，大部分在1.0～2.0μg/100 mL之間，本實驗測定毛葡萄酒中白藜蘆醇含量為49.9μg/100 mL，表明廣西毛葡萄酒中白藜蘆醇的含量高于多數(shù)國產(chǎn)市售葡萄酒。對比侯建波等[20]研究，其測定的75種進口紅葡萄酒的白藜蘆醇苷含量為0.34～5.8 mg/L，本實驗測定毛葡萄酒白藜蘆醇苷含量為26.767 mg/L，表明廣西毛葡萄酒中白藜蘆醇苷含量遠高于部分進口葡萄酒。

從含量分布上看，毛葡萄不同部位白藜蘆醇及其苷的含量差異顯著。白藜蘆醇含量從高到低為：釀酒葡萄皮渣＞鮮果葡萄皮＞鮮果葡萄籽、釀酒葡萄籽，葡萄籽、釀酒葡萄籽只有微量；白藜蘆醇苷含量從高到低為：釀酒皮渣＞鮮果葡萄籽＞鮮果葡萄皮＞釀酒葡萄籽，釀酒葡萄籽只含微量；鮮果中皮、籽含量的差異可能與葡萄不同組織部位間合成白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的能力不同有關；對比釀酒前后，鮮果葡萄籽白藜蘆醇苷遠高于釀酒葡萄籽，表明白藜蘆醇苷容易通過發(fā)酵浸漬進入酒體。前人研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇主要是在葡萄漿果表皮合成[21]，而果肉中白藜蘆醇很少或不存在[22]，與本實驗結果一致。白藜蘆醇和白藜蘆醇苷具有難溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮的理化性質[23]，葡萄酒酒精度約為12%vol，通過發(fā)酵浸漬，葡萄皮和籽中一部分的白藜蘆醇及其苷可以轉移到葡萄酒中，但是釀酒皮渣中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量仍舊很可觀。一般釀酒廠在發(fā)酵結束后會直接把釀酒皮渣當作垃圾直接丟棄，如果我們能利用釀酒皮渣提取富集白藜蘆醇和白藜蘆醇苷，不僅能變廢為寶還避免了對環(huán)境造成污染。本實驗研究為毛葡萄釀酒廢棄物的綜合利用提供了理論依據(jù)。

2.3 精密度實驗

精密稱取毛葡萄皮粉1.0000 g，各平行7次，按照樣品提取方法處理，測定含量，結果表明，葡萄皮中白藜蘆醇平均含量為13.411μg/g，RSD為1.378%，白藜蘆醇苷平均含量為20.859μg/g，RSD為4.610%，表明實驗的提取和測定方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實驗

精密稱取毛葡萄皮粉1.0000 g，按照樣品提取方法處理，在0～12 h內每隔1 h測定1次含量，結果表明，在12 h內葡萄皮內的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷峰面積無明顯變化，13次樣品測定，白藜蘆醇平均含量為13.250μg/g，RSD為2.160%，白藜蘆醇苷平均含量為21.004μg/g，RSD為2.833%，表明樣品提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的測定穩(wěn)定性良好。

2.5 回收率實驗

精密稱取9份各1.0000 g毛葡萄皮干粉，分為3組平行，每組分別加入79μg/mL的白藜蘆醇苷標液各0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL和94μg/mL的白藜蘆醇標液各0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL，每組平行3份，按照樣品提取和測定方法實驗，結果表明，9次實驗白藜蘆醇苷平均回收率為102.040%，RSD為3.080%，白藜蘆醇平均回收率為99.316%，RSD為4.710%，表明本實驗方法回收率良好，可以滿足分析要求。

3 結論

本研究采用HPLC法測定了廣西毛葡萄中葡萄皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒以及釀酒葡萄皮渣、釀酒葡萄籽中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量。葡萄汁中未檢測出白藜蘆醇及其苷，其余樣品均檢測到不同含量的白藜蘆醇及其苷。葡萄酒中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷能通過發(fā)酵浸漬進入葡萄酒中，葡萄釀酒皮渣中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量最高，具備富集利用價值，為利用毛葡萄釀酒皮渣提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的可行性提供了理論依據(jù)。

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Detection of Resveratrol and Piceid Conent in Vitis quinquangularis Rehd and Its Skin Residues

ZHANG Jin,HUANG Xiaoyun,XIE Taili,YANG Ying,GUAN Jingxi,XIE Linjun and CHENG Guo
(Viticulture and Wine Research Institute,Guangxi Academy of Agricultrual Sciences,Nanning,Guangxi 530007,China)

In this study,the distribution of functional components in Vitis quinquangularis Rehd including resveratrol and piceid was explored.HPLC was applied to determine resveratrol and piceid content in Vitis quinquangularis Rehd skin,seed,juice,wine and skin residues.The results showed that,resveratrol and piceid existed in Vitis quinquangularis Rehd skin,seed,wine and skin residues,but not in grape juice;piceid content was higher than resveratrol content in the same part;and the content of resveratrol and picid was the highest in skin residues,which was of high value for industrialized extraction.This study provided theoretical base for comprehensive utilization of Vitis quinquangularis Rehd pomace.

resveratrol;piceid;Vitis quinquangularis Rehd;skin residues

TS262.6；TS261.2；TS261.9

：A

1001-9286（2017）08-0124-04

10.13746/j.njkj.2017039

廣西農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務專項（桂農(nóng)科2015YM05、桂農(nóng)科2015YT85、桂農(nóng)科2015JZ154和桂農(nóng)科2015JZ150）。

2017-02-28

張勁（1986-），男，助理研究員，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏，E-mail：86562900@qq.com。

成果（1987-），女，助理研究員，博士，研究方向為釀酒葡萄生理代謝，E-mail：berry713@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-03-27；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170327.1510.005.html。