篩選口腔扁平苔蘚相關(guān)相關(guān)基因及生物學(xué)通路的研究

隋長德 夏萍 齊春華

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是一種累及口腔黏膜且可反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥疾病，患病率為0.51%，在口腔黏膜疾病中居第2 位，屬常見病[1]。OLP多見于中老年患者，其主要的病理改變是基底細(xì)胞液化變性及上皮下淋巴細(xì)胞浸潤。但是目前，OLP 的病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確，有學(xué)者認(rèn)為心理社會(huì)因素及免疫因素與其有明顯的聯(lián)系，特別是OLP患者自身免疫功能的改變可能在其發(fā)病過程中起到重要作用，如臨床上對(duì)于OLP患者選用免疫調(diào)節(jié)劑治療后，患者的癥狀可有所緩解。

OLP的發(fā)生發(fā)展可能也是由多個(gè)基因綜合作用而導(dǎo)致。因而對(duì)于OLP等病因尚未明確的疾病，越來越多的研究者將目標(biāo)關(guān)注到識(shí)別其發(fā)病過程中的生物學(xué)通路上。生物信息學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)與醫(yī)學(xué)科學(xué)(如生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、生理學(xué))和信息科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)學(xué)等學(xué)科相互滲透并高度交叉形成的一門新興前沿學(xué)科[2]。生物信息學(xué)綜合運(yùn)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)工具，對(duì)高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，進(jìn)而達(dá)到理解這些數(shù)據(jù)中所蘊(yùn)含的生物學(xué)含義。

用于篩選差異表達(dá)基因的基因芯片技術(shù)，具有高通量和快速測(cè)量等優(yōu)點(diǎn)， 在疾病基因的發(fā)現(xiàn)、疾病分子水平診斷、及藥物篩選等許多領(lǐng)域起著巨大推進(jìn)作用。該技術(shù)已經(jīng)成功的被用于包括OLP在內(nèi)的許多疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究當(dāng)中[3-4]。

借助于生物信息學(xué)方法對(duì)以往基因芯片所產(chǎn)生的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，對(duì)于識(shí)別OLP有關(guān)的生物學(xué)通路及關(guān)鍵分子將對(duì)認(rèn)識(shí)、OLP的發(fā)病機(jī)制以及研究新的OLP診斷和治療方法顯得尤為重要。

1 材料及方法

1.1 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析

GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫是當(dāng)前規(guī)模最大、收錄最全、免費(fèi)開放的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫。本研究中的GSE38616取自于基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(GEO)[5]。該數(shù)據(jù)組織樣本取自與7 例OLP患者口腔黏膜及7例健康對(duì)照組口腔黏膜組織，利用芯片Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA) 檢測(cè)了兩組之間的基因表達(dá)情況[4]。為了得到健康和疾病組中的差異表達(dá)基因，本研究利用BRB-ArrayTools v4.2.0[6]中的RMA(robust multi-array analysis)方法對(duì)該原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化處理，用t檢驗(yàn)結(jié)合Benjamini-Hochberg校正的方法[7]分析差異表達(dá)基因，P<0.01認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 富集分析

通過富集分析軟件Toppgene[8]分析上述差異表達(dá)基因及模塊中基因所具有的生物學(xué)通路。Toppgene是一個(gè)在線的界面非常友好的基因集分析工具。在本研究中，僅僅關(guān)注于生物學(xué)通路及細(xì)胞生物學(xué)過程的分析。

1.3 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

STRING 10.0數(shù)據(jù)庫[9]是一個(gè)常用的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫, 數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫中的相互作用包括了蛋白質(zhì)之間直接的相互作用，也包括蛋白質(zhì)間接功能的相關(guān)性?；プ鲾?shù)據(jù)庫中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì)，每條邊代表相連的兩個(gè)蛋白質(zhì)具有互作關(guān)系。該互作關(guān)系來自實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、文本挖掘、數(shù)據(jù)庫以及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)。將上述得到的差異表達(dá)基因映射到該數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)而研究上述基因所編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，以進(jìn)一步理解這些差異表達(dá)基因的具體作用功能。其中，為了使OLP相關(guān)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)更接近于現(xiàn)實(shí)的功能狀態(tài)，只保留交互作用評(píng)分大于0.4的節(jié)點(diǎn)。

1.4 Hub節(jié)點(diǎn)分析

Cytoscape[10]是一個(gè)免費(fèi)開源軟件，該軟件通過其附帶的很多插件可以對(duì)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析并可視化。通過Cytoscape中插件CentiScape[11]對(duì)OLP疾病網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并挖掘其中的Hub節(jié)點(diǎn)。Hub節(jié)點(diǎn)一般是網(wǎng)絡(luò)中度、介數(shù)等最多的節(jié)點(diǎn)，也就是疾病網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置的節(jié)點(diǎn)，與其他蛋白質(zhì)互作最多的節(jié)點(diǎn)，因而其可能在疾病過程中起到關(guān)鍵作用。

1.5 Hub基因在全身的表達(dá)

為了進(jìn)一步明確該上述篩選出來的Hub基因在正常口腔黏膜及全身的表達(dá)情況，我們采用Human eFP Browser 對(duì)該基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.6 GNB2L1在OLP患者外周血中的表達(dá)

由于GNB2L1基因又名人蛋白激酶C受體1(activated protein kinase C1 (RACK1)。采用熒光定量RT-PCR對(duì)口腔扁平苔蘚患者及健康對(duì)照組血清中RACK1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。收集2015～2016 年就診于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔科的口腔扁平苔癬患者20 例(男6 例，女14 例)，健康體檢者20 例(男5 例， 女15 例)。 2 組間性別及年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有參與者均知情同意并有良好的依從性,并且排除其他系統(tǒng)疾病，所有參與者在近1個(gè)月未使用過抗生素等免疫藥物治療。采集患者及健康對(duì)照者晨起空腹外周靜脈血5 ml，加入EDTA 抗凝后，按照全血RNA提取試劑盒(美國Omega 公司)提取試劑盒說明從樣本中提取總RNA。采用日本Takara逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒合成cDNA及RT-PCR定量分析。反應(yīng)體系為25 μl。RACK1引物上游為CACATTGGCCACACAGGCTATC,下游TGTAAAGGTGTTTGCCTTCGTTGA。 β-actin引物上游為TGAAGATCAAGATCATTGCTCCTC，下游為 CACATCTGCTGGAAGGTGGAC。反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性，30 s， 95 ℃15 s， 60 ℃ 15 s， 72 ℃ 30 s(40 個(gè)循環(huán))。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT方法計(jì)算扁平苔蘚組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)差異倍數(shù)。結(jié)果Graph pad Prism 3.0 中的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因及富集分析

對(duì)GSE38616進(jìn)行分析后，P<0.05的差異基因有212 個(gè)，其中上調(diào)45 個(gè)， 下調(diào)167 個(gè)。通過富集分析顯示這些差異表達(dá)基因中212 個(gè)差異表達(dá)基因共富集有29 個(gè)生物學(xué)通路。排在前10的生物學(xué)通路有：G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路(Signaling by GPCR)、嗅覺信號(hào)通路(Olfactory Signaling Pathway)等(表1, 圖1)。 所富集的細(xì)胞生物學(xué)過程有：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)、免疫反應(yīng)(Immune response)、細(xì)胞通訊(Cell communication)，類固醇代謝(Steroid metabolism)、突觸小泡轉(zhuǎn)運(yùn)(Synaptic vesicle transport)等。

2.2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及中心節(jié)點(diǎn)分析

通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫STRING10.0，將OLP相關(guān)的212 個(gè)差異表達(dá)基因映射到PPI中之后，即構(gòu)建OLP相關(guān)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(圖1)。通過Cytoscape中插件CentiScape對(duì)網(wǎng)絡(luò)分析之后，發(fā)現(xiàn)其Hub節(jié)點(diǎn)為RACK1(圖2)。

采用Human eFP Browser[12]，發(fā)現(xiàn)與全身其他組織相比，Hub基因RACK1在口腔黏膜、舌組織中的表達(dá)最高(圖3)。進(jìn)一步提示該基因在口腔黏膜、舌組織中的有著重要作用。

2.3 RACK1在OLP及健康對(duì)照組外周血中的表達(dá)

結(jié)果顯示RACK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量在OLP外周血中的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，大約上調(diào)了近一倍(圖4，t=9.21，P<0.001)。

表1 212 個(gè)差異表達(dá)基因富集的通路(前十個(gè))

圖1 差異表達(dá)基因富集的生物學(xué)通路及生物學(xué)過程

3 討 論

復(fù)雜疾病往往涉及復(fù)雜的生物學(xué)通路異常，而這些通路則依賴于復(fù)雜的基因或蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。通過此網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究，可以發(fā)現(xiàn)疾病過程中特定的細(xì)胞相互作用，還可以從系統(tǒng)水平上識(shí)別疾病相關(guān)基因及疾病相關(guān)生物學(xué)通路[13]。

在過去的幾年中許多研究者通過高通量的方法，如基因芯片技術(shù)，檢測(cè)了OLP患者相對(duì)于健康對(duì)照組的基因表達(dá)情況，得到了成百個(gè)差異表達(dá)基因與OLP相關(guān)。本研究采用生物信息學(xué)方法，成功篩選出212 個(gè)OLP相關(guān)的差異表達(dá)的個(gè)基因，為該疾病的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室研究提供了線索及基礎(chǔ)。

對(duì)上述差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，從系統(tǒng)水平尋找與OLP發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物學(xué)通路。同時(shí)利用OLP與對(duì)照組之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并分析了其中的中心節(jié)點(diǎn)，進(jìn)而從整體上探討了OLP發(fā)病過程中這些差異表達(dá)基因的相互關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)為GNB2L1，該基因又名RACK1(receptor for activated C kinase 1)[14]，該結(jié)果為該疾病的診斷和治療提供了研究方向。很多研究顯示該基因與很多腫瘤的預(yù)后及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)， 如食管鱗狀細(xì)胞癌[15]、結(jié)腸癌[16]、甲狀腺乳頭狀癌[17]、非小細(xì)胞肺癌[18]等。而最近有研究顯示該基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，如可以通過AKT/mTOR通路促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展[19-20]。有學(xué)者也人為口腔鱗狀細(xì)胞癌與OLP存在一定關(guān)聯(lián)[21-23]，結(jié)合本研究中Human eFP Browser[12]結(jié)果， Hub基因GNB2L1在口腔黏膜、舌組織中的表達(dá)最高(圖3)，提示其在口腔黏膜、舌組織中的有著重要作用。通過對(duì)口腔患者外周血檢查的檢查，發(fā)現(xiàn)OLP患者外周血中RACK1表達(dá)比對(duì)照組上升了近一倍，提示該基因RACK1與OLP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

圖2 OLP相關(guān)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

圖3 RACK1 在全身組織中的表達(dá)

圖4 RACK1 在外周血中的表達(dá)

本研究中發(fā)現(xiàn)在29 個(gè)生物學(xué)通路中，前十個(gè)生物學(xué)通路中就有兩個(gè)通路與G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)。如G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路(signaling by GPCR)、G蛋白偶聯(lián)受體下游信號(hào)(GPCR downstream signaling)，可見G蛋白偶聯(lián)受體與OLP有著密切的關(guān)系。G蛋白偶聯(lián)受體是很多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中常見的受體之一，有研究顯示一些G蛋白偶聯(lián)受體與OLP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如 CD184/CXCR-4 跨膜趨化因子受體[24]、組胺4受體[25]等。另外臨床上糜爛性O(shè)LP往往容易產(chǎn)生惡變，而G蛋白歐聯(lián)受體與一些惡性腫瘤有著重要關(guān)系[26]。另外一條值得注意的通路為嗅覺信號(hào)通路(olfactory signaling pathway)，最新的一項(xiàng)病例對(duì)照研究顯示，OLP患者味覺功能相對(duì)于健康對(duì)照組有明顯下降，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[27]，該功能在臨床上往往被患者及醫(yī)生忽視。

另外通過對(duì)差異表達(dá)基因的生物學(xué)過程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因與免疫反應(yīng)相關(guān)。這也再一次從側(cè)面提示免疫功能在OLP發(fā)生發(fā)展過程中的作用，符合OLP患者免疫功能存在一定的紊亂的觀點(diǎn)[28]。

除了上述通路和生物學(xué)過程外，本研究中所發(fā)現(xiàn)的其他一些生物學(xué)通路及生物學(xué)過程，目前還未有文獻(xiàn)報(bào)道，如類固醇代謝(steroid metabolism)、突觸小泡轉(zhuǎn)運(yùn)(synaptic vesicle transport)等。其中類固醇代謝可能和OLP患者經(jīng)常使用類固醇類藥物有關(guān)[29]。而突觸小泡轉(zhuǎn)運(yùn)可能和OLP糜爛引起的疼痛神經(jīng)反射引起[30]，但這些生物學(xué)過程在OLP發(fā)病過程中的具體作用還需進(jìn)一步研究。