犬乳牙根尖周炎對繼承恒牙發(fā)育影響的實(shí)驗(yàn)研究

高黎 吳妍慧 楊敬一 裴海娟 李聚慧 張彥喜

乳牙根尖周炎是常見的兒童口腔疾病，多由牙髓感染發(fā)展而來，它不僅造成患兒咀嚼能力下降，而且可能導(dǎo)致繼承恒牙發(fā)育及萌出異常。臨床許多文獻(xiàn)報道乳磨牙根尖周炎造成繼承前磨牙的萌出及替換異常[1-5]，也有學(xué)者通過建立動物模型觀察到乳牙根尖周炎治療情況及對繼承恒牙萌出時間的影響[6-7]，但很少報道乳前牙根尖周炎對繼承恒牙的影響，對于繼承恒牙超微結(jié)構(gòu)及能譜分析是否異常的研究也未見涉及。本實(shí)驗(yàn)擬建立犬乳前牙根尖周炎模型，觀察乳恒前牙牙齒替換及繼承恒牙的微觀結(jié)構(gòu)和能譜變化。

1 材料與方法

選取6 只40 d齡本地雜交犬，性別不限，隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)犬51-54 和84作為實(shí)驗(yàn)組，61-64和 74作為對照組，兩組各30 顆。術(shù)前6 h禁食、水，使用鹽酸氯胺酮注射液按照4～5 mg/kg的劑量經(jīng)實(shí)驗(yàn)犬腹部肌肉注射。給藥后3～5 min麻醉顯效，主要表現(xiàn)為睜眼凝視及眼球震顫，肢體肌力增強(qiáng)，呈木僵狀態(tài)。麻醉成功后局部注射阿替卡因腎上腺素注射液。固定犬頭部，高速手機(jī)開髓，擴(kuò)大開髓孔，完全暴露髓腔(圖1A)，內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)用0.9%生理鹽水配制成5 mg/ml混懸液過濾除菌后，小棉球蘸LPS液至飽和，隨即將小棉球放入髓腔內(nèi)，調(diào)制氧化鋅丁香油水門汀封閉開髓孔。術(shù)后即刻X線片示暫封良好，乳牙根尖未見異常影像，繼承恒牙牙胚均存在，未見發(fā)育異常(圖1B)， 手術(shù)時間控制在30 min之內(nèi)。

A： 實(shí)驗(yàn)組犬牙開髓照； B：對照組實(shí)驗(yàn)犬牙封入LPS后根尖片

A： Pulp exposing process of the experimental teeth； B： X-ray photo of the experimental teeth with sealed LPS

Fig 1 Instant image and X-ray image of experimental teeth after applying experimental factors

術(shù)后觀察實(shí)驗(yàn)牙齒，相應(yīng)根尖周黏膜色澤，形態(tài)，質(zhì)地變化，并進(jìn)行X線(額定工作電壓220 V，曝光時間0.22 s，間歇式連續(xù)加載運(yùn)行)檢查。

記錄乳恒牙替換情況，待前恒牙完全萌出，尚未建立咬合時(第210 天)，空氣栓塞法處死動物，取得實(shí)驗(yàn)動物頜骨標(biāo)本，觀察繼承恒牙發(fā)育情況。

選取實(shí)驗(yàn)組牙齒釉質(zhì)發(fā)育不全區(qū)及對照組對應(yīng)區(qū)，制成5 mm×3 mm×2 mm牙釉質(zhì)塊,放入蒸餾水超聲震蕩洗滌5 min，蒸餾水反復(fù)沖洗，放入75%乙醇中。掃描前樣品放入預(yù)真空脫水干燥機(jī)中脫水干燥,放入真空鍍膜機(jī)內(nèi),鍍大約300～400 ?厚的金膜用導(dǎo)電膠粘在樣品臺上之后,用掃描電鏡(JSM-7500F， 日本電子公司)對病變牙釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并攝像，并用能譜儀分析其元素構(gòu)成。

2 結(jié) 果

2.1 乳牙根尖周炎形成

實(shí)驗(yàn)動物均成活。術(shù)后2 周時實(shí)驗(yàn)組乳牙冠顏色及相應(yīng)根尖區(qū)黏膜未見異常; 3 周時，部分乳牙根尖區(qū)唇側(cè)黏膜發(fā)現(xiàn)竇道口(圖2A)， X線片示根尖下方可見低密度暗影區(qū)(圖2B); 4 周時X線片示根尖下方低密度暗影區(qū)面積增大，乳牙髓腔變大，根管壁變薄，根尖部吸收(圖2C)，對照組乳牙牙根無吸收，根尖未見低密度暗影。

2.2 實(shí)驗(yàn)組部分繼承恒牙過早萌出

5 個月齡混合牙列期， 實(shí)驗(yàn)組部分繼承恒牙萌出早于對側(cè)對照牙(圖3A); 6 個月齡時部分實(shí)驗(yàn)犬仍處于混合牙列期，乳尖牙未替換，實(shí)驗(yàn)組繼承恒牙萌出早于對側(cè)對照牙(圖3B); X線片示實(shí)驗(yàn)組未萌出繼承恒牙胚在頜骨內(nèi)距牙槽嵴頂?shù)奈恢妹黠@高于對照組繼承恒牙胚(圖3C)， 7 月齡時所有實(shí)驗(yàn)犬恒前牙萌出完畢。各個月齡實(shí)驗(yàn)組恒牙早萌率見表1。

A: 實(shí)驗(yàn)犬3 周口內(nèi)照； B: 實(shí)驗(yàn)犬3 周根尖片； C： 實(shí)驗(yàn)犬4 周根尖片

A: The intraoral image of 3-week experimental teeth; B: X-ray photos of 3-week experimental teeth; C： X-ray photos of 4-week experimental teeth

Fig 2 Establishment of the model of deciduous teeth with apical periodontitis in dogs

2.3 繼承恒牙釉質(zhì)發(fā)育不全

實(shí)驗(yàn)組繼承恒牙有33.3%出現(xiàn)釉質(zhì)發(fā)育不全(10/30)，其中釉質(zhì)著色4 例，恒切牙切端和尖牙牙尖唇側(cè)釉質(zhì)呈白堊色不透明斑塊，釉質(zhì)形態(tài)完好，表面光滑(圖4A)；另有釉質(zhì)缺損6 例，繼承恒切牙唇、腭面，尖牙牙尖部出現(xiàn)散在的釉質(zhì)缺損，呈現(xiàn)點(diǎn)窩狀及帶狀凹陷，缺損處有黃色附著物，牙體顏色正常(圖4B、4C)。對照組繼承恒牙無釉質(zhì)發(fā)育不全。

A: 實(shí)驗(yàn)犬5 月齡口內(nèi)照； B: 實(shí)驗(yàn)犬6 月齡口內(nèi)照； C: 實(shí)驗(yàn)犬7 月齡前牙根尖片

A: The intraoral image of 5-month experimental teeth； B: The intraoral image of 6-month experimental teeth； C: X-ray photos of 7-month experimental teeth

Fig 3 Experimental teeth replacement process from 5 to 7 months of age

A: 實(shí)驗(yàn)犬牙表面釉質(zhì)斑塊； B、 C: 實(shí)驗(yàn)犬牙表面釉質(zhì)凹陷，缺損

A: Plaque on experimental teeth enamel surface； B， C: Hollows and defects on experimental teeth enamel surface

Fig 4 Enamel hypoplasia of experimental teeth

2.4 掃描電鏡結(jié)果

犬正常牙冠：表層無釉柱釉質(zhì)呈片狀分布,無明顯釉柱結(jié)構(gòu)(圖5A)，其余部位釉柱晶體按一定方向緊密排列，釉柱橫斷面呈現(xiàn)近似六棱形結(jié)構(gòu)，釉柱排列整齊，釉柱間質(zhì)均勻，結(jié)構(gòu)清晰(圖5B)。釉質(zhì)著色區(qū)：牙釉質(zhì)表面不平，表層釉質(zhì)缺失，部分釉柱較細(xì)， 頭部呈尖筍樣，局部柱間隙加寬(圖5C)，有少量柱間質(zhì)形成，結(jié)構(gòu)不清晰，大部分柱間質(zhì)缺如(圖5D)。釉質(zhì)缺損區(qū)：牙釉質(zhì)呈現(xiàn)蜂窩狀損害,釉柱中心性破壞, 表層有大小不等的缺損，暴露出下方的牙釉質(zhì)(圖5E)。缺損周圍牙釉質(zhì)呈蜂窩狀，但孔周形狀不清晰，不規(guī)則，空隙深淺大小不一(圖5F)。

Tab 2 Ca, P and Ca/P difference in the 2 groups (n=10,

注： Ca， P含量均為重量百分比

2.5 能譜分析

取釉質(zhì)發(fā)育不全的恒牙病損區(qū)釉質(zhì)的鈣、磷重量百分比及鈣/磷比值，與對照組恒牙相應(yīng)區(qū)域的數(shù)值進(jìn)行比較，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果表2示2 組數(shù)據(jù)之間的鈣、磷含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組釉質(zhì)發(fā)育不全區(qū)的鈣、磷含量低于對照組。鈣磷比2 組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明鈣/磷含量比無明顯差異。

A: ×500； B、 D： ×5 000； C、 E： ×1 000； F： ×2 000

3 討 論

乳牙根尖周炎是兒童口腔臨床中常見的疾病，國內(nèi)外學(xué)者采用多種方法建立根尖周炎動物模型以探討其致病機(jī)制及對繼承恒牙的影響。用于建立實(shí)驗(yàn)性根尖周炎的常用動物有猴、犬、鼠、小型豬等。猴的牙齒各方面均與人特別相似，屬于首選動物，但其價位較高，而且乳恒牙替換大約8～12 個月，周期較長；鼠只有一副牙齒，僅用于根尖周炎模型建立的研究；小型豬牙齒解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，但目前主要用于牙乳頭或牙髓干細(xì)胞在形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體潛能的研究[8]。犬有兩副牙齒，牙齒形態(tài)和乳恒牙替換與人類相似，較易獲得和飼養(yǎng)。建立根尖周炎模型的方法很多，Liu 等[9]將大鼠牙髓暴露，與口腔相通，口內(nèi)的各種細(xì)菌直接進(jìn)入根管，產(chǎn)生根尖周炎癥； CapíK[10]、Katebzadeh等[11]用感染菌斑封閉于犬根管內(nèi)，建立根尖周炎模型；Teixeira等[12]將大鼠開髓后置入LPS棉球并開放于口腔環(huán)境，通過根尖區(qū)X線片及組織病理學(xué)改變，證實(shí)LPS能迅速有效地誘導(dǎo)大鼠根尖周炎的發(fā)生。開放暴露的方法所形成的根尖周病損更貼近自然情況，但是用于犬時需一個月左右。而犬乳牙牙根穩(wěn)定期只有50 d左右，不適用于本實(shí)驗(yàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇LPS誘導(dǎo)犬根尖周炎的方法。犬牙封LPS后3 周時發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)牙唇側(cè)黏膜根尖周區(qū)紅腫，發(fā)現(xiàn)竇道口，部分乳牙根尖區(qū)X線片示根尖下方可見低密度暗影區(qū),說明根尖區(qū)已形成膿腫并破壞骨質(zhì)并突破黏膜。 4 周時X線片示根尖下方低密度暗影區(qū)面積增大，根管壁變薄，根尖部吸收，這與張鷹等[7]應(yīng)用LPS誘導(dǎo)形成乳牙根尖周炎的研究結(jié)果一致，這證明LPS可快速形成犬乳牙根尖周炎。

乳牙及其下方的恒牙胚作為相互依賴不可割的整體，當(dāng)乳牙根尖周炎波及恒牙胚時，局部的施瓦茨曼反應(yīng)(Schwartzman's reaction)可通過激活機(jī)體免疫反應(yīng)，免疫細(xì)胞聚集，產(chǎn)生細(xì)胞因子或激活補(bǔ)體，誘導(dǎo)和釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步造成根尖周組織的破壞[22-23],甚至累及鄰近的繼承恒牙胚。乳牙的根尖周病變對繼承恒牙胚的影響取決于病變程度及牙胚的發(fā)育階段，早期慢性持續(xù)的乳牙根尖周炎癥可能造成繼承恒牙的成釉細(xì)胞水腫受損甚至死亡，致使恒牙出現(xiàn)釉質(zhì)發(fā)育不全，表現(xiàn)為特納牙[2,24]。特納牙屬于局部因素(乳牙根尖周炎癥)所引起的外源性釉質(zhì)發(fā)育不全，依據(jù)Silberman等[25]提出的分類，特納牙(Turner's hypoplasia)分為四型： ①釉質(zhì)著色; ②牙齒異常結(jié)合; ③釉質(zhì)部分缺損; ④以上3 種的混合型。本實(shí)驗(yàn)中乳牙根尖周炎造成的繼承恒牙釉質(zhì)發(fā)育不全屬于特納牙，發(fā)生率為33.3%(10 例)，其中釉質(zhì)著色13.3%(4 例)，釉質(zhì)缺損20%(6 例)，與Warshawsky 等[26]猴乳牙根尖周模型結(jié)果相近。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)釉質(zhì)著色和缺損范圍較小，程度較輕，作者推測可能是前恒牙胚位于乳牙腭側(cè)，距乳牙根尖距離較遠(yuǎn)，同時犬乳恒牙替換期較短，因此，犬乳前牙根尖周炎造成的繼承恒牙釉質(zhì)發(fā)育不全較臨床乳磨牙引起的前磨牙釉質(zhì)發(fā)育不全癥狀輕[1,13]。羥基磷灰石晶體作為牙釉質(zhì)的基本組成成分，其礦化程度與鈣，磷含量緊密相連，文獻(xiàn)認(rèn)為鈣/磷比值可確定硬組織有無脫礦[27]。由于人類特納牙的離體樣本較難獲得，有關(guān)人類特納牙微觀結(jié)構(gòu)及能譜分析其礦化情況的研究鮮有報道，為觀察釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)正常牙釉質(zhì)表面由成片狀分布無釉柱結(jié)構(gòu)的高度鈣化區(qū)和正常釉柱區(qū)構(gòu)成，牙釉柱橫斷面呈現(xiàn)近似六棱形結(jié)構(gòu)，釉柱排列整齊，釉柱間質(zhì)均勻，結(jié)構(gòu)清晰；實(shí)驗(yàn)組變色區(qū)的釉小柱細(xì)長，柱間隙增寬；實(shí)驗(yàn)組釉質(zhì)缺損的表面的無釉柱釉質(zhì)全部缺損，下方的釉柱柱端凹陷，孔隙大小不同，深淺不一，結(jié)構(gòu)紊亂。本研究能譜分析發(fā)現(xiàn)釉質(zhì)發(fā)育不全區(qū)鈣、磷含量均值均較正常區(qū)域低，作者推測這可能與釉質(zhì)發(fā)育不全區(qū)釉柱細(xì)小，柱間隙增寬有一定關(guān)系。該區(qū)釉柱結(jié)構(gòu)紊亂，羥磷灰石晶體排列不規(guī)則，容易脫礦引起齲病發(fā)生。釉質(zhì)發(fā)育不全區(qū)鈣磷比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，再次證明乳牙根尖周炎引起的繼承恒牙的釉質(zhì)發(fā)育不全與遺傳性釉質(zhì)發(fā)育不全有所不同，它主要是影響繼承恒牙釉質(zhì)數(shù)量的形成，并不影響已形成釉質(zhì)的鈣化及成熟。

由于物種差異，與人類相比，動物乳恒牙替換周期較短，動物模型不能完全模擬人乳牙根尖周病的真實(shí)情況。乳恒牙替換是一個多種因素相互作用的、復(fù)雜有序的生理過程。據(jù)文獻(xiàn)報道，因人乳恒牙替換周期較長，乳牙根尖周炎致乳牙早失后，繼承恒牙早萌與乳牙缺失時間有一定關(guān)系，當(dāng)乳牙缺失發(fā)生在繼承恒牙正常萌出時間前1年左右時，繼承恒牙早萌；若時間過早，繼承恒牙則表現(xiàn)為遲萌[28-29]。而乳牙的根尖周病變絕大多數(shù)是由牙髓病或牙髓感染發(fā)展而來，由于乳牙自身的解剖生理因素導(dǎo)致感染易于擴(kuò)散且持續(xù)時間長，不易局限化。受到病源刺激后，人乳牙根尖周病可以急性爆發(fā)的形式呈現(xiàn)，也可以在機(jī)體抵抗力較強(qiáng)或經(jīng)過不徹底的根管治療后逐漸轉(zhuǎn)為慢性病程。隨著人們口腔健康意識的提高及患兒及時就診率的增加，口腔醫(yī)師可通過制作阻萌器，及時拔除或治療病變?nèi)檠?，以及固定過早萌出松動的恒牙等措施，早期干預(yù)以盡可能保存患兒的年輕恒牙。鑒于本實(shí)驗(yàn)的局限性，臨床工作中我們應(yīng)注意收集相關(guān)病例資料以進(jìn)行下一步有關(guān)早萌繼承恒牙發(fā)病率及礦化程度影響的研究。