施萬(wàn)細(xì)胞通過NT-3/TrkC信號(hào)通路促進(jìn)SACC嗜神經(jīng)侵襲的研究

郭佳 李歡 王珺 雷德林 楊新杰

唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma， SACC)約占唾液腺惡性腫瘤的30%[1]。嗜神經(jīng)侵襲(perineural invasion，PNI)特性是其顯著的生物學(xué)特征之一。PNI常導(dǎo)致患者出現(xiàn)頭痛、感覺麻木、面癱等周圍神經(jīng)受損癥狀[2]。有研究表明，SACC的PNI不僅破壞被侵襲神經(jīng)的結(jié)構(gòu)與功能，還成為腫瘤侵襲和代謝的新機(jī)制[3]。但其明確的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制至今仍未完全闡明。因此，對(duì)SACC的PNI特性的深入研究是改善SACC預(yù)后的關(guān)鍵。

相關(guān)研究表明，神經(jīng)周圍的腫瘤微環(huán)境能夠提高腫瘤的侵襲力[4]。施萬(wàn)細(xì)胞(Schwann Cells, SCs)作為腫瘤微環(huán)境的一個(gè)關(guān)鍵因素，能影響腫瘤微環(huán)境的變化[5]。課題組過去的研究發(fā)現(xiàn)Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中的表達(dá)與SACC的臨床病理特征密切相關(guān)[6]，此外BDNF/TrkB信號(hào)通路影響SACC細(xì)胞與SCs之間的相互作用，誘導(dǎo)SACC細(xì)胞的EMT和施萬(wàn)細(xì)胞樣分化過程，增強(qiáng)其神經(jīng)侵襲能力[7]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)SCs出現(xiàn)在胰腺癌和結(jié)腸癌的腫瘤侵襲邊界，這表明在PNI過程中是神經(jīng)而非腫瘤首先遷移[8]。以上研究表明SCs被視作SACC嗜神經(jīng)侵襲行為的早期啟動(dòng)者，對(duì)腫瘤細(xì)胞的信號(hào)作出應(yīng)答，在PNI過程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，有研究表明在有PNI現(xiàn)象的胰腺癌和前列腺癌中發(fā)現(xiàn)NT-3的過表達(dá)[9-10]。也有研究發(fā)現(xiàn)NT-3激活SACC細(xì)胞的TrkC特異性受體，通過下游Ras、Erk1/2、Ark和Bcl信號(hào)通路來提高SACC的侵襲能力[11]。PNI的生物學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，目前關(guān)于腫瘤-神經(jīng)之間復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究仍處于起步階段。本實(shí)驗(yàn)采用SACC細(xì)胞與SCs共培養(yǎng)、Transwell 嗜神經(jīng)侵襲實(shí)驗(yàn)及3D共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)檢測(cè)，旨在驗(yàn)證NT-3/TrkC 信號(hào)通路在SACC 嗜神經(jīng)侵襲過程中發(fā)揮的重要作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

唾液腺腺樣囊性癌細(xì)胞系SACC-83(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院); NT-3抗體(1∶5 000)、 TrkC(1∶2 000)、 β-actin(1∶2 000)(GeneTex公司，美國(guó)); Goat Anti-Mouse IgG HRP二抗(1∶5 000， Affinity，美國(guó))， NT-3細(xì)胞因子(20 ng/ml， PeproTech公司，美國(guó))； Transwell 小室(0.4 μm，Corning公司，美國(guó))； Duoset?ELISA試劑盒(R&D公司，美國(guó))；EpochTM超微量微孔板分光光度計(jì)(BioTek公司，美國(guó))； RNA提取試劑盒、 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara Bio公司，日本)； 熒光定量PCR儀(BIBBY PrimeQ，英國(guó))； ChemiDocTMXRS+ Image LabTMSoftware(BIO-RAD，美國(guó))； 倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

唾液腺腺樣囊性癌細(xì)胞系SACC-83培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基，置37 ℃， 5% CO2培養(yǎng)箱。 SCs的原代培養(yǎng)取SD 大鼠仔鼠(1～3 d)坐骨神經(jīng)， 0.25%胰酶消化(不含EDTA)，接種于預(yù)先多聚賴氨酸(PLL)包被的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。經(jīng)消化法原代培養(yǎng)的SCs采用差速貼壁法分離純化。

1.3 SACC-83細(xì)胞和SCs共培養(yǎng)

采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，孔徑0.4 μm，共培養(yǎng)小室下層接種SACC-83細(xì)胞(密度1×104/cm2)，上層用多聚賴氨酸預(yù)包被后接種SCs(密度1×105/cm2)。起初在6 孔板上室接種SCs，待其完全貼壁后更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，后與接種于下室的SACC-83(SACC-83 細(xì)胞與SCs同步饑餓處理)共培養(yǎng)，更換含0.1% BSA 的RPMI-1640 培養(yǎng)液。72 h 后收集共培養(yǎng)前后的腫瘤細(xì)胞與SCs，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 ELISA檢測(cè)

采用Duoset?ELISA試劑盒進(jìn)行NT-3 的ELISA 檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，分別將100 μl待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)的孔中，置37 ℃， 40 min，洗板5 次，后依次加入生物素化的抗體，HRP標(biāo)記的鏈酶卵白素，TMB底物反應(yīng)相應(yīng)時(shí)間，中途洗板5 次，加入終止液，混勻后用EpochTM超微量微孔板分光光度計(jì)測(cè)量A值，測(cè)量波長(zhǎng)為450 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度, 橫坐標(biāo)為A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出NT-3 含量。

1.5 RT-PCR

SACC-83細(xì)胞及SCs中的總RNA使用RNA提取試劑盒提取，并測(cè)量各組樣本RNA 的濃度和純度(EpochTM超微量微孔板分光光度計(jì))； 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并采用熒光定量PCR儀以及PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。其中NT-3、TrkC和β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司定制合成，具體序列見表1。以β-actin為參照基因，測(cè)得共培養(yǎng)前后SACC-83細(xì)胞和SCs中NT-3、TrkC基因的相對(duì)表達(dá)量，繪制柱狀圖。

表1 PCR所用引物序列

注： F: 上游引物; R: 下游引物

1.6 Western blot

提取各組細(xì)胞總蛋白, 蛋白定量采用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒。常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后封閉，用NT-3、TrkC和β-actin 4 ℃孵育過夜，洗膜，Goat Anti-Mouse IgG HRP二抗(1∶5 000，Affinity)室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，用ChemiDocTMXRS+Image LabTMSoftware檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，目的蛋白表達(dá)的相對(duì)水平為目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)

SACC-83 細(xì)胞被接種于Transwell 小室下室，上室依次為空白對(duì)照、SCs和NT-3。實(shí)驗(yàn)依照劃痕實(shí)驗(yàn)標(biāo)本步驟進(jìn)行， 24 h后倒置相差顯微鏡下采集圖片，測(cè)量各個(gè)組腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)距離。

1.8 Transwell嗜神經(jīng)侵襲實(shí)驗(yàn)

SACC-83細(xì)胞 (5×104/cm2) 和SCs (5×105/cm2)分別被接種于Transwell小室的上下室，模擬腫瘤神經(jīng)相互作用。24 h后，沒有遷移的細(xì)胞被擦除，依次進(jìn)行PBS緩沖液漂洗，95%乙醇固定，結(jié)晶紫溶液染色。倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)獨(dú)立視野，計(jì)數(shù)各個(gè)組穿過Transwell膜的細(xì)胞數(shù)量。

1.9 3D共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

SACC-83細(xì)胞(5×103/cm2)和SCs(5×103/cm2)分別與細(xì)胞外基質(zhì)混合，相鄰培養(yǎng)組之間的距離為1 mm。實(shí)驗(yàn)利用ECM連接橋產(chǎn)生化學(xué)吸引梯度。NT-3 (20 ng/ml)和不含細(xì)胞的ECM混合來模擬SACC-83細(xì)胞微環(huán)境中高表達(dá)NT-3細(xì)胞因子，不含細(xì)胞成分的ECM作為空白對(duì)照。72 h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組連接橋處的細(xì)胞情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析比較各組中NT-3、TrkC 的表達(dá)差異；劃痕實(shí)驗(yàn)中SACC-83細(xì)胞的遷徙距離和Transwell嗜神經(jīng)侵襲實(shí)驗(yàn)中穿膜細(xì)胞數(shù)的差異采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SACC-83和SCs細(xì)胞正常生長(zhǎng)(圖1)。

2.2 SACC-83細(xì)胞和SCs相互作用下NT-3和TrkC的表達(dá)

采用ELISA測(cè)定培養(yǎng)液中NT-3的濃度，結(jié)果顯示共培養(yǎng)組的NT-3濃度顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)組(P<0.05)，共培養(yǎng)SACC-83細(xì)胞組的NT-3的增幅顯著大于共培養(yǎng)SCs組的增幅(P<0.05)(圖2A)。

圖1 細(xì)胞形態(tài) (倒置顯微鏡， ×200)

Fig 1 Cell morphology (Inverted microscope, ×200)

RT-PCR和Western Blot的結(jié)果顯示共培養(yǎng)SACC-83細(xì)胞組中NT-3基因和蛋白水平的表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)(圖2B、 2D)。共培養(yǎng)SACC-83細(xì)胞組中TrkC基因和蛋白水平的表達(dá)量略有升高(P<0.05)(圖2、 2D)。而且共培養(yǎng)組SCs的TrkC基因和蛋白水平的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)(圖2C、 2D)，NT-3基因和蛋白水平的表達(dá)量略有升高(P<0.05)(圖2C、 2D)。

圖2 SACC-83細(xì)胞和SCs相互作用時(shí)，NT-3和TrkC的表達(dá)情況

2.3 SACC細(xì)胞和SCs相互作用下侵襲遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)表明，共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞組以及NT-3處理組的遷移能力顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)組(P<0.05)(圖3A)。 同時(shí)，SACC-83細(xì)胞共培養(yǎng)組，SCs共培養(yǎng)組和NT-3處理組的侵襲能力明顯高于其單獨(dú)培養(yǎng)組(P<0.05)(圖3C、3D)。

3D共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察SACC-83細(xì)胞和SCs的相互作用過程，結(jié)果表明，在SACC-83細(xì)胞侵襲SCs之前，SCs已經(jīng)早期定向趨化遷移至腫瘤細(xì)胞，與此同時(shí)SCs也向NT-3 高濃度區(qū)發(fā)生有規(guī)律的移動(dòng)，而對(duì)照組沒有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象(圖3B)。

3 討 論

SACC嗜神經(jīng)侵襲的微環(huán)境由許多細(xì)胞成分組成[12-13]。SCs作為腫瘤微環(huán)境的一個(gè)關(guān)鍵因素， 能夠影響腫瘤微環(huán)境的變化[5]。有研究發(fā)現(xiàn)SCs出現(xiàn)在胰腺癌和結(jié)腸癌的侵襲邊界。這個(gè)獨(dú)特的現(xiàn)象表明，與腫瘤侵襲神經(jīng)的傳統(tǒng)假設(shè)相反，胰腺癌和結(jié)腸癌的PNI過程中，神經(jīng)細(xì)胞首先向腫瘤遷移，即除了腫瘤對(duì)神經(jīng)的單方面侵襲之外，在PNI過程中SCs的早期主動(dòng)參與也起了極為重要的作用。許多研究表明腫瘤和神經(jīng)周圍的微環(huán)境不僅支持腫瘤生長(zhǎng)、增殖和擴(kuò)散，還有助于SCs的早期遷移[4-5]。

圖3 共培養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力(A、 C、 D： ×100; B: ×200)

NT-3是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一個(gè)可溶性小分子蛋白，有調(diào)節(jié)多種神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、生長(zhǎng)和再生的功能[14]。有研究表明，NT-3及其受體TrkC在胰腺癌[9，15]和結(jié)腸癌[16]中過表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)組NT-3和TrkC的表達(dá)較單獨(dú)培養(yǎng)組顯著升高，這提示NT-3和TrkC在腫瘤-神經(jīng)相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，在NT-3的刺激下，TrkC發(fā)生酪氨酸磷酸化，激活下游信號(hào)，細(xì)胞向著NT-3發(fā)生趨化移動(dòng)[11]。有研究表明NT-3對(duì)背根神經(jīng)節(jié)軸突有趨化作用[17]，并且NT-3/TrkC信號(hào)通路能顯著增強(qiáng)SCs的遷移，但NGF和BDNF都沒有這個(gè)能力[18]。3D培養(yǎng)系統(tǒng)為細(xì)胞提供基質(zhì)，和體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境非常相似[19]。因此，3D培養(yǎng)系統(tǒng)不僅能維持體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)，還可直觀反映和控制細(xì)胞培養(yǎng)的條件。本研究的3D培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在SACC-83 細(xì)胞侵襲SCs之前，SCs已經(jīng)早期定向趨化遷移至腫瘤細(xì)胞，與此同時(shí)SCs也向NT-3 高濃度區(qū)發(fā)生有規(guī)律的移動(dòng)，而對(duì)照組沒有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象； 有趣的是， 觀察到早期幾乎沒有SACC-83向SCs遷移。

本實(shí)驗(yàn)采用3D培養(yǎng)系統(tǒng)模擬出腫瘤細(xì)胞早期嗜神經(jīng)侵襲的進(jìn)程。NT-3在腫瘤-神經(jīng)相互作用中高表達(dá)，同時(shí)，通過激活特異性受體TrkC，促進(jìn)SCs向NT-3高濃度區(qū)域遷移，即NT-3介導(dǎo)神經(jīng)和腫瘤之間的相互作用，從而啟動(dòng)腫瘤的嗜神經(jīng)侵襲。實(shí)驗(yàn)證實(shí)NT-3及其受體TrkC 介導(dǎo)了SACC 與神經(jīng)組織內(nèi)的SCs的相互吸引和遷移作用，從而在SACC 嗜神經(jīng)侵襲中發(fā)揮重要調(diào)控作用。涎腺腺樣囊性癌可以分泌一定濃度的NT-3，并且表達(dá)NT-3 的高親和力受體TrkC。故在腫瘤周圍形成了以SACC 為中心的NT-3濃度梯度。而NT-3 結(jié)合于SCs上的TrkC 受體，能顯著增強(qiáng)SCs的遷移能力，故SCs于腫瘤嗜神經(jīng)侵襲發(fā)生之前先趨化運(yùn)動(dòng)至腫瘤細(xì)胞，而后刺激腫瘤細(xì)胞分泌大量的NT-3。NT-3 作用于SACC 細(xì)胞增強(qiáng)其侵襲遷移能力，并可作用于SCs，誘導(dǎo)SCs向腫瘤方向趨化生長(zhǎng)。

本研究初步表明，SACC和SCs的相互作用促進(jìn)了NT-3在腫瘤微環(huán)境的表達(dá)與分布，同時(shí)NT-3/TrkC信號(hào)通路可能介導(dǎo)了SCs向腫瘤細(xì)胞的遷移，因此促進(jìn)了嗜神經(jīng)侵襲的發(fā)生。但是，NT-3/TrkC信號(hào)通路是否為嗜神經(jīng)侵襲的唯一通路，以及阻斷此通路能否阻斷PNI進(jìn)程仍需進(jìn)一步的研究。