• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    棉花光籽基因n2的精細(xì)定位

    2019-04-10 08:27:56李思敏左東云程海亮張友平王巧連劉珂馮曉旭耿洪偉宋國立
    棉花學(xué)報(bào) 2019年2期
    關(guān)鍵詞:親本突變體單株

    李思敏,左東云,程海亮,張友平,王巧連,劉珂,馮曉旭,耿洪偉,宋國立*

    (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),烏魯木齊830052;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南安陽455000)

    棉花(Gossypium)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)一直是育種的重要目標(biāo)[1-2]。一般認(rèn)為纖維細(xì)胞是以線性細(xì)胞生長模式進(jìn)行延伸,由胚珠外表皮細(xì)胞發(fā)育而成[3-4]。棉花纖維的分化和發(fā)育包括原始細(xì)胞的分化和突起(開花后-3~3 d)、纖維細(xì)胞的伸長(開花后2~20 d)、次生壁加厚(開花后15~45 d)和脫水成熟(開花后45~50 d)4 個(gè)階段,各個(gè)階段之間相互重疊,沒有明顯的界限,纖維細(xì)胞的分化時(shí)間決定纖維的長度,長纖維在早期分化,而短纖維在晚期分化。棉纖維的品質(zhì)性狀主要包括纖維長度、強(qiáng)度、伸長率、馬克隆值等,這些性狀主要受基因型的控制,其中纖維的起始與伸長直接影響纖維的數(shù)量與長度,而次生壁加厚期纖維素的合成則影響纖維的強(qiáng)度與馬克隆值等性狀[5]。

    棉花纖維發(fā)育過程與擬南芥(Arabidopsis)毛狀體發(fā)育具有相似性?,F(xiàn)已證明,MYB 家族蛋白在擬南芥毛狀體發(fā)育和棉纖維生長發(fā)育中都有重要作用,而復(fù)合體MYB-bHLH-WD40(MBW)控制擬南芥毛狀體的啟動(dòng),主要包括GL1、GL3和TTG1 這3 個(gè)基因[6-10]??刂泼蘩w維起始的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因(MYB25-like)編碼MIXTA 類的MYB 轉(zhuǎn)錄因子,與形成MBW 的GL1 屬于不同類型,在纖維發(fā)育過程中不可缺失;干涉Gh-MYB25-like基因,可導(dǎo)致棉花種子無纖維,其他部分毛狀體不受影響[11-14]。目前,棉花中存在多種纖維發(fā)育突變體,主要有陸地棉無絨有絮突變體N1和n2,超短纖維突變體Li1、Li2和Li3,無絨無絮突變體MD17、SL1-7-1 和XZ142。從20 世紀(jì)初,前人就開始了對陸地棉光籽突變體的遺傳研究。Thadania 等研究認(rèn)為,陸地棉光籽無短絨性狀是單基因控制的顯性性狀[15-16]。Kohel 等分別把顯性光籽基因N1和隱性光籽基因n2定位在同源染色體12 和26 號(hào)上[17]。Endrizzi 等采用單端體定位的方法,將光籽基因n2定位到染色體D12 上[18]。而Rong 等認(rèn)為n2位于染色體A12 上[19]。宋麗等在海陸群體中將n2定位在染色體A12 上,在陸陸群體中將n2定位在了D12 上[20]。

    本研究以陸地棉光籽突變體n2和海島棉新海21 為親本配制雜交組合,收獲F1種子,并自交產(chǎn)生F2群體,對該群體纖維發(fā)育性狀進(jìn)行調(diào)查和遺傳分析,完成光籽基因n2的初步定位和精細(xì)定位,對候選區(qū)間進(jìn)行基因預(yù)測,克隆候選基因,并分析其在親本中的表達(dá)差異,為揭示n2基因控制棉花纖維起始的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料與表型數(shù)據(jù)收集

    本試驗(yàn)配制雜交組合所用親本材料為海島棉品種新海21(Xinhai 21)和陸地棉光籽突變體n2,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所種質(zhì)中期庫提供,并由本課題在田間進(jìn)行多年連續(xù)自交保存。2個(gè)親本纖維發(fā)育性狀穩(wěn)定,新海21 的表型為短絨,n2的表型為光籽。用其配制的F1也經(jīng)過多年調(diào)查,纖維發(fā)育表型性狀同新海21 一致。

    本試驗(yàn)共構(gòu)建2 個(gè)F2群體,群體Ⅰ由554 個(gè)單株組成,群體Ⅱ由3 443 個(gè)單株組成。表型性狀分為有短絨和無短絨(光籽)2 種。選取F2群體各單株上成熟開裂的棉鈴,去除長纖維后觀察棉籽上短絨的有無,每次均與親本比對,與新海21 表型一致的標(biāo)記為有短絨,與n2表型一致的標(biāo)記為光籽。但在分離群體中,有一些處于中間表型的單株,其種子表面大部分為光籽,僅在珠孔端和合點(diǎn)端有少量短絨,在性狀調(diào)查時(shí),參照Du 等[21]和丁業(yè)掌等[22]的分類方法,將其歸為光籽。進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn),以確定F2群體性狀是否符合3∶1 的分離比。

    1.2 DNA的提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)

    采用宋國立等[23]改良的CTAB 法從親本和F2群體的新鮮葉組織中提取基因組DNA。所有引物由蘇州金唯智生物科技有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司合成。配制PCR 反應(yīng)體系所用到的TaqDNA 聚合酶、10×PCR Buffer 以及dNTPs 等試劑均購自北京全式金基因生化科技有限公司。PCR 反應(yīng)體系中模板DNA 30 ng,2.5 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL,10×PCR Buffer 1 μL,5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.1 μL,10 μmol·L-1正反向引物各0.2 μL,加ddH2O至10 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 ℃5 min;94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃1 min,25 個(gè)循環(huán);72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物用8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

    1.3 分子標(biāo)記的開發(fā)

    宋麗等[20]將n2基因定位在A12 上標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM 區(qū)間內(nèi)。利用軟件SciRoKo 34 在A12 序列中查找簡單序列重復(fù)(Simple sequence repeat,SSR)位點(diǎn),并將得到的引物于2 個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選。當(dāng)n2基因縮小到?jīng)]有可用的多態(tài)性SSR 標(biāo)記的區(qū)間范圍后,對任意序列進(jìn)行擴(kuò)增,用于加密圖譜。所有引物序列均由Primer 5 軟件獲得。

    1.4 基因的精細(xì)定位

    從群體Ⅰ中挑選200 個(gè)單株進(jìn)行初步定位,其中包括150 株毛籽單株,50 株光籽單株。利用Joinmap 4.0 進(jìn)行連鎖分析。通過作圖將n2基因定位到標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM(centimorgan)區(qū)間后,根據(jù)SSR 在染色體上的位置提取目標(biāo)區(qū)間的序列,繼續(xù)設(shè)計(jì)新的SSR 引物,并篩選出具有多態(tài)性的引物,用得到的引物擴(kuò)增群體Ⅱ所有單株的DNA,根據(jù)重組數(shù)據(jù),將目標(biāo)區(qū)域鎖定在更小的范圍內(nèi)。

    1.5 定位區(qū)間候選基因預(yù)測

    根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果得到候選區(qū)間,從棉花注釋數(shù)據(jù)庫(http://cgp.genomics.org.cn)獲得預(yù)測的基因序列,并在表達(dá)序列標(biāo)簽(Expression sequence tag,EST)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對以確認(rèn)預(yù)測基因的準(zhǔn)確性,進(jìn)而獲得候選基因。

    1.6 候選基因的表達(dá)量分析

    采集開花-3 d、-1 d、0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d 的胚珠,用天恩澤基因科技公司的RNAout 2.0 試劑盒提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄所用試劑盒PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)和熒光定量試劑盒TaKaRa SYBR Premix ExTaqⅡ(Perfect Real Time)均購自寶生物(大連)生物公司。實(shí)時(shí)熒光定量(Quantitative real time,qRT)-PCR 反應(yīng)體系:模板cDNA 2 μL,10 μmol·L-1正、反向引物各0.8 μL,SYBR?RPremix ExTaqⅡ (2×)10 μL,ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL,ddH2O 6 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃30 s;95 ℃5 s,60 ℃30 s,40 個(gè)循環(huán);95 ℃15 s,60 ℃1 min,95 ℃15 s(ABIPRISM@7500-Fast Real-Time PCR system)。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物,內(nèi)參基因設(shè)為ACTIN,引物信息參見表1。表達(dá)量分析用2-ΔΔCt法。

    表1 qRT-PCR所用基因及引物序列Table 1 Genes and primers used in qRT-PCR verification

    2 結(jié)果與分析

    2.1 性狀調(diào)查及遺傳分析

    對2 個(gè)F2分離群體的3 997 個(gè)單株進(jìn)行田間性狀調(diào)查,對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到光籽單株690 株,毛籽單株2 994 株,中間性狀單株313株(歸為光籽類型[21-22])。結(jié)果顯示,2 個(gè)群體的纖維發(fā)育性狀分離比為3∶1??ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果顯示,分離群體的性狀分離比符合孟德爾遺傳分離規(guī)律(χ2=0.59<χ20.05=3.84),與前人的研究結(jié)果[20]一致。

    2.2 SSR標(biāo)記的開發(fā)與篩選

    結(jié)合AD 基因組序列,首先在70~76 Mbp 區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)了96 對引物,均分布在A12 上。將各引物在2 個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選,共得到20 對多態(tài)性SSR 標(biāo)記。利用這20 對引物進(jìn)行連鎖分析,得到13 對與目標(biāo)基因連鎖的標(biāo)記(表2)。當(dāng)n2基因縮小到?jīng)]有可用的多態(tài)性SSR 標(biāo)記區(qū)間范圍后,對任意序列進(jìn)行擴(kuò)增,在親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選,得到10 對與目標(biāo)基因緊密連鎖的SSR 標(biāo)記(表2)。

    2.3 光籽基因n2的初步定位

    宋麗等[20]將n2基因定位在A12 上標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM 區(qū)間內(nèi)。本試驗(yàn)在進(jìn)一步加密遺傳圖譜的基礎(chǔ)上,驗(yàn)證了該區(qū)間的準(zhǔn)確性。從群體Ⅰ中挑選200 個(gè)極端單株的小群體,其中包括50 株光籽單株,150 株毛籽單株,結(jié)合已有的結(jié)果和新的SSR 標(biāo)記在該群體中的交換率,將目標(biāo)區(qū)域鎖定在了NAU0943 和Z10之間,物理距離約為615 kbp(圖1a)。

    表2 與n2基因連鎖的標(biāo)記Table 2 Polymorphic markers linked with the n2 gene

    圖1 n2基因的定位Fig.1 Mapping of n2 gene

    2.4 光籽基因n2的精細(xì)定位

    初步定位得到10 個(gè)與目標(biāo)基因緊密連鎖的SSR 標(biāo)記,為驗(yàn)證定位區(qū)間并進(jìn)一步縮小n2的范圍,以這10 個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增群體Ⅱ所有單株的DNA,根據(jù)重組數(shù)據(jù),進(jìn)一步將候選區(qū)間縮小至P61 與Z10 之間(圖1b,c),物理距離181 kbp。

    2.5 候選區(qū)間基因預(yù)測

    以候選區(qū)間的基因組參考序列進(jìn)行基因預(yù)測,結(jié)合基因組的注釋結(jié)果,在181 kbp 的序列中存在7 個(gè)預(yù)測基因,分別為1414、1415、72098、1417、1418、1419、1420(表3)。

    2.6 候選基因的表達(dá)量分析

    候選基因中,72098 在所選時(shí)期的2 個(gè)親本中的表達(dá)量都有顯著差異(圖2),而其他6個(gè)基因在2 個(gè)親本中的表達(dá)量沒有顯著差異。這說明在棉花胚珠中,該基因表達(dá)量的不同可能是造成纖維發(fā)育性狀差異的原因,它可能在光籽形成中起重要作用。

    表3 定位區(qū)間內(nèi)7個(gè)候選基因的注釋及基因全長Table 3 Annotation and full length of seven candidate genes in mapping interval

    圖2 候選基因72098在2個(gè)親本中的相對表達(dá)量比較Fig.2 Expression analysis of the candidate gene 72098 in the parents

    3 討論與結(jié)論

    棉花纖維作為天然紡織原料在國民生產(chǎn)中舉足輕重,而纖維突變體,尤其是光籽突變體更是棉花遺傳育種上重要的種質(zhì)資源。陸地棉纖維突變體的遺傳研究,可以豐富陸地棉種質(zhì)資源。而棉種上附著的短絨纖維往往可能攜帶許多病菌,易造成各類病害(如黃萎病等)的發(fā)生[24]。如果棉種上有短絨,則會(huì)嚴(yán)重阻礙種子的吸水膨脹,從而影響發(fā)芽率,使棉花生產(chǎn)受到一定的影響。而光籽突變體材料具有種子不易傳播病蟲害且吸水快,出苗整齊,纖維強(qiáng)度好,纖維容易從種子上分離等優(yōu)點(diǎn),是棉花育種的重要資源。該研究以陸地棉光籽突變體為切入點(diǎn),對棉纖維材料進(jìn)行生物學(xué)研究,進(jìn)而闡明棉纖維分化發(fā)育的分子機(jī)理,對進(jìn)一步提高棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

    陸地棉纖維發(fā)育突變體一般是由于1 個(gè)或少數(shù)幾個(gè)質(zhì)量性狀基因發(fā)生突變造成的。前人研究表明,n2位于 A12 上標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM 區(qū)間內(nèi)[20]。但該距離對于基因克隆或育種利用來說不夠接近。隨著棉花基因組序列的發(fā)展,利用高分辨率遺傳圖譜和全基因組序列,大大加快了基因定位和克隆的步伐[25-27]。在本研究中,我們選取陸地棉光籽突變體n2及海島棉品種新海21 為親本,為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性,構(gòu)建了2 個(gè)分離群體,分別用于n2基因的初步定位和精細(xì)定位,定位群體達(dá)3 997 個(gè)單株。根據(jù)棉花基因組序列,開發(fā)了一批染色體特異的分子標(biāo)記,當(dāng)目標(biāo)區(qū)域鎖定到較小范圍之內(nèi)后,根據(jù)重組單株的個(gè)數(shù),確定目標(biāo)基因的候選區(qū)間,并用連鎖標(biāo)記擴(kuò)增群體Ⅱ所有單株的DNA,以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。原則上,如果群體數(shù)目增大,得到的重組單株數(shù)目就越多,定位區(qū)間也越小。最后,n2基因被定位在染色體A12 上181 kbp 區(qū)間內(nèi),定位區(qū)間中含有7 個(gè)候選基因,并通過檢索EST 庫得到確認(rèn)。候選基因的qRT-PCR 分析結(jié)果顯示,基因72098 在所選時(shí)期的2 個(gè)親本中的表達(dá)量都有顯著差異,而其他6個(gè)基因在2 個(gè)親本中的表達(dá)量沒有顯著差異。

    基因72098 編碼蛋白激酶。據(jù)報(bào)道,擬南芥中含有多個(gè)鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs)基因,其中有成員被報(bào)道與根毛生長或花粉管通道伸長有關(guān)。cDNA 芯片及qRT-PCR 的數(shù)據(jù)均顯示CPK1、CPK32 和CPK5 的表達(dá)在纖維伸長期顯著升高。利用CDPK 的通用底物檢測棉纖維發(fā)育不同時(shí)期鈣離子依賴型蛋白激酶總活性發(fā)現(xiàn),隨著纖維的伸長,CDPK 總活性顯著增加,在開花后10~15 d達(dá)到最高。在沒有纖維的棉花突變體中,CDPK總活性一直維持在較低水平,提示CDPK 類激酶在纖維發(fā)育過程中扮演重要角色[28-29]。由此我們猜測,基因72098 可能在光籽形成中起重要的作用,且為候選基因的可能性較大。但光籽表型的差異是由于基因序列本身差異還是表達(dá)量差異引起的,亦或者是兩者共同作用導(dǎo)致的,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

    猜你喜歡
    親本突變體單株
    甘蔗親本農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)與分析
    中國糖料(2023年4期)2023-11-01 09:34:46
    無為市太平山楓香樹不同單株葉片性狀多樣性分析
    幾種蘋果砧木實(shí)生后代與親本性狀的相關(guān)性
    種植密度與行距對秋閑田飼用甜高粱單株生產(chǎn)力的影響
    湖南速生、中生、慢生闊葉樹組單株生長模型構(gòu)建
    CLIC1及其點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白的共定位研究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制探究
    云瑞10系列生產(chǎn)性創(chuàng)新親本2種方法評(píng)價(jià)
    Survivin D53A突變體對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
    秋播蠶豆品種主要農(nóng)藝性狀相關(guān)性和通徑分析
    国产精品一区二区在线不卡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久女婷五月综合色啪小说| 五月伊人婷婷丁香| 国产视频首页在线观看| 国产乱来视频区| 国产高清三级在线| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 人人澡人人妻人| 欧美日韩av久久| 丝瓜视频免费看黄片| 人妻一区二区av| 交换朋友夫妻互换小说| 美女国产视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产成人精品在线电影| 桃花免费在线播放| 久久国内精品自在自线图片| 男女午夜视频在线观看 | 国产精品免费大片| 九色亚洲精品在线播放| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 九色成人免费人妻av| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 久久久国产一区二区| 人妻人人澡人人爽人人| 三上悠亚av全集在线观看| 久久久久久久久久成人| 婷婷色综合大香蕉| 精品少妇内射三级| 丁香六月天网| 亚洲av日韩在线播放| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 18禁动态无遮挡网站| 欧美人与善性xxx| 只有这里有精品99| 午夜免费鲁丝| 久久精品国产亚洲av天美| 五月开心婷婷网| 中文字幕人妻熟女乱码| 丝袜美足系列| 日本91视频免费播放| 老司机影院毛片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日日啪夜夜爽| 久久人妻熟女aⅴ| 色吧在线观看| a 毛片基地| 国产淫语在线视频| 丝袜人妻中文字幕| 看免费av毛片| 亚洲伊人色综图| 久久女婷五月综合色啪小说| 大码成人一级视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久狼人影院| 免费高清在线观看视频在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 另类精品久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 街头女战士在线观看网站| 在线观看国产h片| 人妻系列 视频| 成人综合一区亚洲| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品三级大全| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲国产精品999| 超色免费av| 在线观看国产h片| 性色av一级| 亚洲性久久影院| 大香蕉久久成人网| 91在线精品国自产拍蜜月| 美女视频免费永久观看网站| 看十八女毛片水多多多| 爱豆传媒免费全集在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久亚洲国产成人精品v| 18在线观看网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美成人午夜精品| 黄色一级大片看看| 各种免费的搞黄视频| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 搡老乐熟女国产| 秋霞在线观看毛片| 国产成人精品福利久久| 成人国产麻豆网| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 午夜福利,免费看| 欧美日韩视频精品一区| 好男人视频免费观看在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久久久久久久成人| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲av电影在线进入| 久久精品人人爽人人爽视色| 男女下面插进去视频免费观看 | 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品一二三区在线看| 日韩一区二区视频免费看| 22中文网久久字幕| 欧美另类一区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 在线看a的网站| 午夜激情久久久久久久| 超碰97精品在线观看| 精品酒店卫生间| 色婷婷av一区二区三区视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品美女久久av网站| 视频区图区小说| 好男人视频免费观看在线| 国产精品久久久av美女十八| 一级,二级,三级黄色视频| 国产激情久久老熟女| 国产精品99久久99久久久不卡 | 一个人免费看片子| 中文天堂在线官网| 久久久久久久精品精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 免费观看av网站的网址| 两个人看的免费小视频| 亚洲伊人色综图| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产69精品久久久久777片| 十八禁网站网址无遮挡| 草草在线视频免费看| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲第一av免费看| 欧美精品一区二区免费开放| 久久精品国产综合久久久 | 成人影院久久| av在线app专区| 国产免费一级a男人的天堂| 激情五月婷婷亚洲| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费av不卡在线播放| 在线观看三级黄色| 黄色 视频免费看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 各种免费的搞黄视频| 51国产日韩欧美| 人妻一区二区av| 国产一区二区在线观看av| 精品一区二区三区视频在线| 黄色配什么色好看| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 天天操日日干夜夜撸| 久久影院123| 一边摸一边做爽爽视频免费| 美国免费a级毛片| 成人国产av品久久久| 亚洲美女视频黄频| 在现免费观看毛片| 亚洲国产日韩一区二区| 国产成人精品婷婷| 熟妇人妻不卡中文字幕| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品第一国产精品| 亚洲国产精品国产精品| 91国产中文字幕| 99久久综合免费| 久久久国产欧美日韩av| av播播在线观看一区| 丰满少妇做爰视频| 熟女av电影| 精品一区二区免费观看| 妹子高潮喷水视频| 久久99一区二区三区| 9色porny在线观看| 在线观看人妻少妇| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美人与性动交α欧美软件 | 中文字幕av电影在线播放| av在线老鸭窝| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲国产精品国产精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 美国免费a级毛片| 97超碰精品成人国产| 精品国产一区二区久久| 51国产日韩欧美| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 少妇的逼好多水| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久久久久久久人人人人人人| 一级毛片电影观看| 三上悠亚av全集在线观看| 成年人免费黄色播放视频| www日本在线高清视频| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产伦理片在线播放av一区| videosex国产| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品成人av观看孕妇| h视频一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 777米奇影视久久| 大香蕉97超碰在线| 免费黄频网站在线观看国产| 全区人妻精品视频| 黑人高潮一二区| av不卡在线播放| 午夜影院在线不卡| 男女免费视频国产| 日韩av免费高清视频| 一二三四在线观看免费中文在 | 中文天堂在线官网| 一本色道久久久久久精品综合| 中国国产av一级| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲,欧美精品.| 日韩人妻精品一区2区三区| 有码 亚洲区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲人成网站在线观看播放| a级毛片在线看网站| 国产高清国产精品国产三级| 少妇熟女欧美另类| 亚洲,欧美,日韩| 制服诱惑二区| 男男h啪啪无遮挡| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲人成网站在线观看播放| 午夜老司机福利剧场| 在现免费观看毛片| 午夜福利乱码中文字幕| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲最大av| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲国产看品久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 成人影院久久| 午夜免费观看性视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 韩国av在线不卡| 中文字幕人妻丝袜制服| 好男人视频免费观看在线| 亚洲国产精品999| 国产男人的电影天堂91| 伊人久久国产一区二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 麻豆乱淫一区二区| 精品福利永久在线观看| 热re99久久国产66热| av视频免费观看在线观看| 日日撸夜夜添| 久久精品国产a三级三级三级| 日本与韩国留学比较| 在现免费观看毛片| 免费观看在线日韩| 精品久久久精品久久久| 免费高清在线观看日韩| 日日爽夜夜爽网站| 日本黄色日本黄色录像| 综合色丁香网| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 制服人妻中文乱码| 日韩一区二区视频免费看| av免费在线看不卡| 国产在线一区二区三区精| 国产精品一国产av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| av网站免费在线观看视频| 久久精品国产综合久久久 | 两个人看的免费小视频| 亚洲精品一二三| 精品午夜福利在线看| 欧美成人午夜免费资源| 欧美bdsm另类| 香蕉精品网在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 欧美最新免费一区二区三区| 久久韩国三级中文字幕| 国产在线免费精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美激情 高清一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 日日啪夜夜爽| 亚洲伊人久久精品综合| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲熟女精品中文字幕| 激情视频va一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 夫妻性生交免费视频一级片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 新久久久久国产一级毛片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 男女高潮啪啪啪动态图| 三上悠亚av全集在线观看| 日本黄大片高清| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品.久久久| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久久久视频综合| 亚洲四区av| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 看非洲黑人一级黄片| 一本大道久久a久久精品| 97超碰精品成人国产| 搡女人真爽免费视频火全软件| 热99国产精品久久久久久7| 18+在线观看网站| 看非洲黑人一级黄片| 老司机亚洲免费影院| 熟女av电影| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 国产 一区精品| 最近手机中文字幕大全| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美成人午夜免费资源| 美女大奶头黄色视频| 搡老乐熟女国产| 中文字幕制服av| 欧美xxⅹ黑人| 国产片内射在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品国产露脸久久av麻豆| 91久久精品国产一区二区三区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 交换朋友夫妻互换小说| av在线播放精品| 精品一区二区三卡| 黄片无遮挡物在线观看| 精品国产国语对白av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 国产精品.久久久| 欧美少妇被猛烈插入视频| 免费黄网站久久成人精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 日韩大片免费观看网站| 黄色 视频免费看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产成人a∨麻豆精品| tube8黄色片| 女人精品久久久久毛片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 我的女老师完整版在线观看| 国产成人精品一,二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品一区二区三卡| 免费av中文字幕在线| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品欧美亚洲77777| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 色5月婷婷丁香| 欧美精品av麻豆av| 午夜福利,免费看| 免费大片18禁| 捣出白浆h1v1| 男男h啪啪无遮挡| 国产成人精品在线电影| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产极品天堂在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 波多野结衣一区麻豆| 国产精品久久久久久久久免| 精品国产乱码久久久久久小说| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产一区二区在线观看日韩| 国产乱人偷精品视频| 我的女老师完整版在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 国国产精品蜜臀av免费| av视频免费观看在线观看| 欧美精品av麻豆av| 免费看光身美女| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 99视频精品全部免费 在线| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 啦啦啦啦在线视频资源| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产深夜福利视频在线观看| 少妇的丰满在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 欧美精品av麻豆av| 免费看光身美女| 卡戴珊不雅视频在线播放| 女性生殖器流出的白浆| 欧美人与性动交α欧美软件 | 蜜桃国产av成人99| 久久这里只有精品19| 亚洲国产精品国产精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产免费又黄又爽又色| 久久ye,这里只有精品| 天天影视国产精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费av中文字幕在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 岛国毛片在线播放| 午夜激情久久久久久久| 久久久久久人人人人人| 全区人妻精品视频| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲图色成人| 免费人妻精品一区二区三区视频| 五月天丁香电影| 亚洲中文av在线| 免费大片18禁| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日韩中文字幕视频在线看片| 18禁观看日本| 国产精品成人在线| 亚洲国产色片| 精品熟女少妇av免费看| av卡一久久| 深夜精品福利| 亚洲内射少妇av| 在线观看人妻少妇| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 黄色 视频免费看| 国产精品成人在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 只有这里有精品99| 高清毛片免费看| 一本色道久久久久久精品综合| 久久婷婷青草| 国产精品女同一区二区软件| 久久女婷五月综合色啪小说| a级毛片黄视频| 国产精品国产三级专区第一集| 国产精品久久久久久久久免| av免费在线看不卡| 热99久久久久精品小说推荐| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | av线在线观看网站| 一边亲一边摸免费视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 丰满少妇做爰视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产一级毛片在线| 一本色道久久久久久精品综合| 秋霞伦理黄片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品一区二区在线观看99| 久久国内精品自在自线图片| 丝袜人妻中文字幕| 蜜桃国产av成人99| 成人国产av品久久久| 在线观看www视频免费| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产又爽黄色视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产一区二区激情短视频 | 久久狼人影院| 黄色怎么调成土黄色| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品一区www在线观看| 制服诱惑二区| 丝袜喷水一区| 制服人妻中文乱码| 亚洲人成77777在线视频| av女优亚洲男人天堂| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲av在线观看美女高潮| 九色成人免费人妻av| 99国产精品免费福利视频| 性色avwww在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品一二三| 亚洲成人手机| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 九九爱精品视频在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 久久婷婷青草| 国产精品免费大片| 久久久久久人人人人人| 国产色婷婷99| 亚洲精品乱久久久久久| 久久精品国产a三级三级三级| 少妇人妻 视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 天堂中文最新版在线下载| 人妻人人澡人人爽人人| 波野结衣二区三区在线| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| av国产精品久久久久影院| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| kizo精华| 久久影院123| 日韩成人伦理影院| 欧美性感艳星| 久久精品国产亚洲av涩爱| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品美女久久av网站| 免费观看无遮挡的男女| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 午夜福利视频精品| videosex国产| 日韩欧美精品免费久久| 美女脱内裤让男人舔精品视频| av电影中文网址| 亚洲av日韩在线播放| 9热在线视频观看99| 伊人亚洲综合成人网| 国产黄色视频一区二区在线观看| 男女边摸边吃奶| a级毛色黄片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 成年女人在线观看亚洲视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜视频国产福利| 国产精品久久久久久av不卡| 1024视频免费在线观看| 97在线人人人人妻| 精品第一国产精品| 日本免费在线观看一区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲情色 制服丝袜| 日本免费在线观看一区| 免费看av在线观看网站| 少妇的丰满在线观看| 伊人久久国产一区二区| 搡老乐熟女国产| 熟女电影av网| 蜜桃国产av成人99| 一边亲一边摸免费视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 九色亚洲精品在线播放| www.色视频.com| 久久久欧美国产精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲av中文av极速乱| 国产日韩欧美亚洲二区| 9色porny在线观看| 男女免费视频国产| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品欧美亚洲77777| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品一二三区在线看| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产精品无大码| 国产色婷婷99| 毛片一级片免费看久久久久| 视频在线观看一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 日本爱情动作片www.在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 国产亚洲最大av| 中文字幕人妻丝袜制服| 晚上一个人看的免费电影| 九色成人免费人妻av| 亚洲av电影在线进入| 丰满饥渴人妻一区二区三| 五月玫瑰六月丁香| 女性生殖器流出的白浆| 日韩一区二区三区影片| 一本色道久久久久久精品综合| 国产在线视频一区二区| 国产精品一区www在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 在线精品无人区一区二区三| 欧美国产精品va在线观看不卡| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品国产av在线观看| 国产在视频线精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜视频国产福利| 又黄又粗又硬又大视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人午夜福利电影在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 男人添女人高潮全过程视频| 精品少妇内射三级| 成人手机av| 午夜福利乱码中文字幕| av电影中文网址| 少妇被粗大猛烈的视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 视频区图区小说| 人妻一区二区av| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲国产精品专区欧美| 久久精品国产亚洲av涩爱| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲精品色激情综合| 国产免费现黄频在线看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 大码成人一级视频|