• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    棉花光籽基因n2的精細(xì)定位

    2019-04-10 08:27:56李思敏左東云程海亮張友平王巧連劉珂馮曉旭耿洪偉宋國立
    棉花學(xué)報(bào) 2019年2期
    關(guān)鍵詞:親本突變體單株

    李思敏,左東云,程海亮,張友平,王巧連,劉珂,馮曉旭,耿洪偉,宋國立*

    (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),烏魯木齊830052;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南安陽455000)

    棉花(Gossypium)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)一直是育種的重要目標(biāo)[1-2]。一般認(rèn)為纖維細(xì)胞是以線性細(xì)胞生長模式進(jìn)行延伸,由胚珠外表皮細(xì)胞發(fā)育而成[3-4]。棉花纖維的分化和發(fā)育包括原始細(xì)胞的分化和突起(開花后-3~3 d)、纖維細(xì)胞的伸長(開花后2~20 d)、次生壁加厚(開花后15~45 d)和脫水成熟(開花后45~50 d)4 個(gè)階段,各個(gè)階段之間相互重疊,沒有明顯的界限,纖維細(xì)胞的分化時(shí)間決定纖維的長度,長纖維在早期分化,而短纖維在晚期分化。棉纖維的品質(zhì)性狀主要包括纖維長度、強(qiáng)度、伸長率、馬克隆值等,這些性狀主要受基因型的控制,其中纖維的起始與伸長直接影響纖維的數(shù)量與長度,而次生壁加厚期纖維素的合成則影響纖維的強(qiáng)度與馬克隆值等性狀[5]。

    棉花纖維發(fā)育過程與擬南芥(Arabidopsis)毛狀體發(fā)育具有相似性?,F(xiàn)已證明,MYB 家族蛋白在擬南芥毛狀體發(fā)育和棉纖維生長發(fā)育中都有重要作用,而復(fù)合體MYB-bHLH-WD40(MBW)控制擬南芥毛狀體的啟動(dòng),主要包括GL1、GL3和TTG1 這3 個(gè)基因[6-10]??刂泼蘩w維起始的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因(MYB25-like)編碼MIXTA 類的MYB 轉(zhuǎn)錄因子,與形成MBW 的GL1 屬于不同類型,在纖維發(fā)育過程中不可缺失;干涉Gh-MYB25-like基因,可導(dǎo)致棉花種子無纖維,其他部分毛狀體不受影響[11-14]。目前,棉花中存在多種纖維發(fā)育突變體,主要有陸地棉無絨有絮突變體N1和n2,超短纖維突變體Li1、Li2和Li3,無絨無絮突變體MD17、SL1-7-1 和XZ142。從20 世紀(jì)初,前人就開始了對陸地棉光籽突變體的遺傳研究。Thadania 等研究認(rèn)為,陸地棉光籽無短絨性狀是單基因控制的顯性性狀[15-16]。Kohel 等分別把顯性光籽基因N1和隱性光籽基因n2定位在同源染色體12 和26 號(hào)上[17]。Endrizzi 等采用單端體定位的方法,將光籽基因n2定位到染色體D12 上[18]。而Rong 等認(rèn)為n2位于染色體A12 上[19]。宋麗等在海陸群體中將n2定位在染色體A12 上,在陸陸群體中將n2定位在了D12 上[20]。

    本研究以陸地棉光籽突變體n2和海島棉新海21 為親本配制雜交組合,收獲F1種子,并自交產(chǎn)生F2群體,對該群體纖維發(fā)育性狀進(jìn)行調(diào)查和遺傳分析,完成光籽基因n2的初步定位和精細(xì)定位,對候選區(qū)間進(jìn)行基因預(yù)測,克隆候選基因,并分析其在親本中的表達(dá)差異,為揭示n2基因控制棉花纖維起始的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料與表型數(shù)據(jù)收集

    本試驗(yàn)配制雜交組合所用親本材料為海島棉品種新海21(Xinhai 21)和陸地棉光籽突變體n2,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所種質(zhì)中期庫提供,并由本課題在田間進(jìn)行多年連續(xù)自交保存。2個(gè)親本纖維發(fā)育性狀穩(wěn)定,新海21 的表型為短絨,n2的表型為光籽。用其配制的F1也經(jīng)過多年調(diào)查,纖維發(fā)育表型性狀同新海21 一致。

    本試驗(yàn)共構(gòu)建2 個(gè)F2群體,群體Ⅰ由554 個(gè)單株組成,群體Ⅱ由3 443 個(gè)單株組成。表型性狀分為有短絨和無短絨(光籽)2 種。選取F2群體各單株上成熟開裂的棉鈴,去除長纖維后觀察棉籽上短絨的有無,每次均與親本比對,與新海21 表型一致的標(biāo)記為有短絨,與n2表型一致的標(biāo)記為光籽。但在分離群體中,有一些處于中間表型的單株,其種子表面大部分為光籽,僅在珠孔端和合點(diǎn)端有少量短絨,在性狀調(diào)查時(shí),參照Du 等[21]和丁業(yè)掌等[22]的分類方法,將其歸為光籽。進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn),以確定F2群體性狀是否符合3∶1 的分離比。

    1.2 DNA的提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)

    采用宋國立等[23]改良的CTAB 法從親本和F2群體的新鮮葉組織中提取基因組DNA。所有引物由蘇州金唯智生物科技有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司合成。配制PCR 反應(yīng)體系所用到的TaqDNA 聚合酶、10×PCR Buffer 以及dNTPs 等試劑均購自北京全式金基因生化科技有限公司。PCR 反應(yīng)體系中模板DNA 30 ng,2.5 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL,10×PCR Buffer 1 μL,5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.1 μL,10 μmol·L-1正反向引物各0.2 μL,加ddH2O至10 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 ℃5 min;94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃1 min,25 個(gè)循環(huán);72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物用8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

    1.3 分子標(biāo)記的開發(fā)

    宋麗等[20]將n2基因定位在A12 上標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM 區(qū)間內(nèi)。利用軟件SciRoKo 34 在A12 序列中查找簡單序列重復(fù)(Simple sequence repeat,SSR)位點(diǎn),并將得到的引物于2 個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選。當(dāng)n2基因縮小到?jīng)]有可用的多態(tài)性SSR 標(biāo)記的區(qū)間范圍后,對任意序列進(jìn)行擴(kuò)增,用于加密圖譜。所有引物序列均由Primer 5 軟件獲得。

    1.4 基因的精細(xì)定位

    從群體Ⅰ中挑選200 個(gè)單株進(jìn)行初步定位,其中包括150 株毛籽單株,50 株光籽單株。利用Joinmap 4.0 進(jìn)行連鎖分析。通過作圖將n2基因定位到標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM(centimorgan)區(qū)間后,根據(jù)SSR 在染色體上的位置提取目標(biāo)區(qū)間的序列,繼續(xù)設(shè)計(jì)新的SSR 引物,并篩選出具有多態(tài)性的引物,用得到的引物擴(kuò)增群體Ⅱ所有單株的DNA,根據(jù)重組數(shù)據(jù),將目標(biāo)區(qū)域鎖定在更小的范圍內(nèi)。

    1.5 定位區(qū)間候選基因預(yù)測

    根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果得到候選區(qū)間,從棉花注釋數(shù)據(jù)庫(http://cgp.genomics.org.cn)獲得預(yù)測的基因序列,并在表達(dá)序列標(biāo)簽(Expression sequence tag,EST)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對以確認(rèn)預(yù)測基因的準(zhǔn)確性,進(jìn)而獲得候選基因。

    1.6 候選基因的表達(dá)量分析

    采集開花-3 d、-1 d、0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d 的胚珠,用天恩澤基因科技公司的RNAout 2.0 試劑盒提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄所用試劑盒PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)和熒光定量試劑盒TaKaRa SYBR Premix ExTaqⅡ(Perfect Real Time)均購自寶生物(大連)生物公司。實(shí)時(shí)熒光定量(Quantitative real time,qRT)-PCR 反應(yīng)體系:模板cDNA 2 μL,10 μmol·L-1正、反向引物各0.8 μL,SYBR?RPremix ExTaqⅡ (2×)10 μL,ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL,ddH2O 6 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃30 s;95 ℃5 s,60 ℃30 s,40 個(gè)循環(huán);95 ℃15 s,60 ℃1 min,95 ℃15 s(ABIPRISM@7500-Fast Real-Time PCR system)。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物,內(nèi)參基因設(shè)為ACTIN,引物信息參見表1。表達(dá)量分析用2-ΔΔCt法。

    表1 qRT-PCR所用基因及引物序列Table 1 Genes and primers used in qRT-PCR verification

    2 結(jié)果與分析

    2.1 性狀調(diào)查及遺傳分析

    對2 個(gè)F2分離群體的3 997 個(gè)單株進(jìn)行田間性狀調(diào)查,對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到光籽單株690 株,毛籽單株2 994 株,中間性狀單株313株(歸為光籽類型[21-22])。結(jié)果顯示,2 個(gè)群體的纖維發(fā)育性狀分離比為3∶1??ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果顯示,分離群體的性狀分離比符合孟德爾遺傳分離規(guī)律(χ2=0.59<χ20.05=3.84),與前人的研究結(jié)果[20]一致。

    2.2 SSR標(biāo)記的開發(fā)與篩選

    結(jié)合AD 基因組序列,首先在70~76 Mbp 區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)了96 對引物,均分布在A12 上。將各引物在2 個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選,共得到20 對多態(tài)性SSR 標(biāo)記。利用這20 對引物進(jìn)行連鎖分析,得到13 對與目標(biāo)基因連鎖的標(biāo)記(表2)。當(dāng)n2基因縮小到?jīng)]有可用的多態(tài)性SSR 標(biāo)記區(qū)間范圍后,對任意序列進(jìn)行擴(kuò)增,在親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選,得到10 對與目標(biāo)基因緊密連鎖的SSR 標(biāo)記(表2)。

    2.3 光籽基因n2的初步定位

    宋麗等[20]將n2基因定位在A12 上標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM 區(qū)間內(nèi)。本試驗(yàn)在進(jìn)一步加密遺傳圖譜的基礎(chǔ)上,驗(yàn)證了該區(qū)間的準(zhǔn)確性。從群體Ⅰ中挑選200 個(gè)極端單株的小群體,其中包括50 株光籽單株,150 株毛籽單株,結(jié)合已有的結(jié)果和新的SSR 標(biāo)記在該群體中的交換率,將目標(biāo)區(qū)域鎖定在了NAU0943 和Z10之間,物理距離約為615 kbp(圖1a)。

    表2 與n2基因連鎖的標(biāo)記Table 2 Polymorphic markers linked with the n2 gene

    圖1 n2基因的定位Fig.1 Mapping of n2 gene

    2.4 光籽基因n2的精細(xì)定位

    初步定位得到10 個(gè)與目標(biāo)基因緊密連鎖的SSR 標(biāo)記,為驗(yàn)證定位區(qū)間并進(jìn)一步縮小n2的范圍,以這10 個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增群體Ⅱ所有單株的DNA,根據(jù)重組數(shù)據(jù),進(jìn)一步將候選區(qū)間縮小至P61 與Z10 之間(圖1b,c),物理距離181 kbp。

    2.5 候選區(qū)間基因預(yù)測

    以候選區(qū)間的基因組參考序列進(jìn)行基因預(yù)測,結(jié)合基因組的注釋結(jié)果,在181 kbp 的序列中存在7 個(gè)預(yù)測基因,分別為1414、1415、72098、1417、1418、1419、1420(表3)。

    2.6 候選基因的表達(dá)量分析

    候選基因中,72098 在所選時(shí)期的2 個(gè)親本中的表達(dá)量都有顯著差異(圖2),而其他6個(gè)基因在2 個(gè)親本中的表達(dá)量沒有顯著差異。這說明在棉花胚珠中,該基因表達(dá)量的不同可能是造成纖維發(fā)育性狀差異的原因,它可能在光籽形成中起重要作用。

    表3 定位區(qū)間內(nèi)7個(gè)候選基因的注釋及基因全長Table 3 Annotation and full length of seven candidate genes in mapping interval

    圖2 候選基因72098在2個(gè)親本中的相對表達(dá)量比較Fig.2 Expression analysis of the candidate gene 72098 in the parents

    3 討論與結(jié)論

    棉花纖維作為天然紡織原料在國民生產(chǎn)中舉足輕重,而纖維突變體,尤其是光籽突變體更是棉花遺傳育種上重要的種質(zhì)資源。陸地棉纖維突變體的遺傳研究,可以豐富陸地棉種質(zhì)資源。而棉種上附著的短絨纖維往往可能攜帶許多病菌,易造成各類病害(如黃萎病等)的發(fā)生[24]。如果棉種上有短絨,則會(huì)嚴(yán)重阻礙種子的吸水膨脹,從而影響發(fā)芽率,使棉花生產(chǎn)受到一定的影響。而光籽突變體材料具有種子不易傳播病蟲害且吸水快,出苗整齊,纖維強(qiáng)度好,纖維容易從種子上分離等優(yōu)點(diǎn),是棉花育種的重要資源。該研究以陸地棉光籽突變體為切入點(diǎn),對棉纖維材料進(jìn)行生物學(xué)研究,進(jìn)而闡明棉纖維分化發(fā)育的分子機(jī)理,對進(jìn)一步提高棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

    陸地棉纖維發(fā)育突變體一般是由于1 個(gè)或少數(shù)幾個(gè)質(zhì)量性狀基因發(fā)生突變造成的。前人研究表明,n2位于 A12 上標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM 區(qū)間內(nèi)[20]。但該距離對于基因克隆或育種利用來說不夠接近。隨著棉花基因組序列的發(fā)展,利用高分辨率遺傳圖譜和全基因組序列,大大加快了基因定位和克隆的步伐[25-27]。在本研究中,我們選取陸地棉光籽突變體n2及海島棉品種新海21 為親本,為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性,構(gòu)建了2 個(gè)分離群體,分別用于n2基因的初步定位和精細(xì)定位,定位群體達(dá)3 997 個(gè)單株。根據(jù)棉花基因組序列,開發(fā)了一批染色體特異的分子標(biāo)記,當(dāng)目標(biāo)區(qū)域鎖定到較小范圍之內(nèi)后,根據(jù)重組單株的個(gè)數(shù),確定目標(biāo)基因的候選區(qū)間,并用連鎖標(biāo)記擴(kuò)增群體Ⅱ所有單株的DNA,以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。原則上,如果群體數(shù)目增大,得到的重組單株數(shù)目就越多,定位區(qū)間也越小。最后,n2基因被定位在染色體A12 上181 kbp 區(qū)間內(nèi),定位區(qū)間中含有7 個(gè)候選基因,并通過檢索EST 庫得到確認(rèn)。候選基因的qRT-PCR 分析結(jié)果顯示,基因72098 在所選時(shí)期的2 個(gè)親本中的表達(dá)量都有顯著差異,而其他6個(gè)基因在2 個(gè)親本中的表達(dá)量沒有顯著差異。

    基因72098 編碼蛋白激酶。據(jù)報(bào)道,擬南芥中含有多個(gè)鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs)基因,其中有成員被報(bào)道與根毛生長或花粉管通道伸長有關(guān)。cDNA 芯片及qRT-PCR 的數(shù)據(jù)均顯示CPK1、CPK32 和CPK5 的表達(dá)在纖維伸長期顯著升高。利用CDPK 的通用底物檢測棉纖維發(fā)育不同時(shí)期鈣離子依賴型蛋白激酶總活性發(fā)現(xiàn),隨著纖維的伸長,CDPK 總活性顯著增加,在開花后10~15 d達(dá)到最高。在沒有纖維的棉花突變體中,CDPK總活性一直維持在較低水平,提示CDPK 類激酶在纖維發(fā)育過程中扮演重要角色[28-29]。由此我們猜測,基因72098 可能在光籽形成中起重要的作用,且為候選基因的可能性較大。但光籽表型的差異是由于基因序列本身差異還是表達(dá)量差異引起的,亦或者是兩者共同作用導(dǎo)致的,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

    猜你喜歡
    親本突變體單株
    甘蔗親本農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)與分析
    中國糖料(2023年4期)2023-11-01 09:34:46
    無為市太平山楓香樹不同單株葉片性狀多樣性分析
    幾種蘋果砧木實(shí)生后代與親本性狀的相關(guān)性
    種植密度與行距對秋閑田飼用甜高粱單株生產(chǎn)力的影響
    湖南速生、中生、慢生闊葉樹組單株生長模型構(gòu)建
    CLIC1及其點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白的共定位研究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制探究
    云瑞10系列生產(chǎn)性創(chuàng)新親本2種方法評(píng)價(jià)
    Survivin D53A突變體對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
    秋播蠶豆品種主要農(nóng)藝性狀相關(guān)性和通徑分析
    99久久国产精品久久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲片人在线观看| 成人影院久久| 亚洲中文av在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 1024视频免费在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久精品91无色码中文字幕| 精品国产亚洲在线| 国产精品久久电影中文字幕| 中文字幕高清在线视频| 在线观看免费午夜福利视频| 香蕉丝袜av| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久99久视频精品免费| 天天添夜夜摸| 欧美乱码精品一区二区三区| 成人手机av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美大码av| 1024视频免费在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲午夜理论影院| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲av美国av| 久久国产精品影院| 久久草成人影院| 淫秽高清视频在线观看| 男人舔女人的私密视频| 香蕉久久夜色| 亚洲免费av在线视频| 91成年电影在线观看| 亚洲伊人色综图| 丰满的人妻完整版| 亚洲五月婷婷丁香| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产高清国产精品国产三级| 精品免费久久久久久久清纯| 最好的美女福利视频网| 亚洲av五月六月丁香网| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产免费现黄频在线看| 国产一区在线观看成人免费| 中文字幕精品免费在线观看视频| 日本三级黄在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 免费高清视频大片| 午夜精品国产一区二区电影| 国产在线精品亚洲第一网站| 久99久视频精品免费| 最好的美女福利视频网| 一级a爱视频在线免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜精品久久久久久毛片777| 视频区欧美日本亚洲| 免费日韩欧美在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 18禁国产床啪视频网站| 丝袜在线中文字幕| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 多毛熟女@视频| 日韩三级视频一区二区三区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产激情久久老熟女| www.999成人在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 午夜日韩欧美国产| 久久久国产成人精品二区 | 成人永久免费在线观看视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 午夜免费激情av| 久久性视频一级片| 丝袜人妻中文字幕| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 一区福利在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 两性夫妻黄色片| 国产精品亚洲一级av第二区| 超碰成人久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产成人精品在线电影| 亚洲片人在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产亚洲欧美98| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 午夜福利在线在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 免费观看精品视频网站| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲内射少妇av| 日本与韩国留学比较| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲在线观看片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 丁香欧美五月| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产免费男女视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 日本熟妇午夜| 脱女人内裤的视频| 日韩欧美在线二视频| 国产成人aa在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 欧美午夜高清在线| 不卡一级毛片| 国产熟女xx| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产 一区 欧美 日韩| 一个人观看的视频www高清免费观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 婷婷精品国产亚洲av| 日本一本二区三区精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 午夜老司机福利剧场| 国产精华一区二区三区| 日韩高清综合在线| 国产真实乱freesex| 国产真实乱freesex| 国产黄色小视频在线观看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲 国产 在线| 看十八女毛片水多多多| 国产成人啪精品午夜网站| 国产69精品久久久久777片| 能在线免费观看的黄片| 俺也久久电影网| 一夜夜www| 免费高清视频大片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲色图av天堂| 日韩大尺度精品在线看网址| 内地一区二区视频在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品三级大全| 日韩人妻高清精品专区| 在线观看66精品国产| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美成人免费av一区二区三区| 中国美女看黄片| 亚洲黑人精品在线| 51午夜福利影视在线观看| 久久精品国产自在天天线| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲最大成人中文| 国产激情偷乱视频一区二区| www.熟女人妻精品国产| 好男人在线观看高清免费视频| 成人午夜高清在线视频| 国产黄色小视频在线观看| 精品久久国产蜜桃| 美女大奶头视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美最新免费一区二区三区 | 男人舔女人下体高潮全视频| 国产免费男女视频| 国产乱人伦免费视频| 午夜福利在线在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久人人精品亚洲av| 婷婷精品国产亚洲av| 国产亚洲精品av在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产一区二区三区视频了| 国产高潮美女av| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久香蕉精品热| 日韩中文字幕欧美一区二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 免费无遮挡裸体视频| 成人av一区二区三区在线看| www日本黄色视频网| 99久久精品热视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 丝袜美腿在线中文| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 极品教师在线免费播放| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲黑人精品在线| 亚洲人与动物交配视频| 女人被狂操c到高潮| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产欧美日韩一区二区三| av欧美777| 丰满人妻一区二区三区视频av| av国产免费在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美bdsm另类| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美日韩乱码在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 日韩有码中文字幕| 精品日产1卡2卡| 级片在线观看| 日本一本二区三区精品| 久久久久久久久中文| 国产精品99久久久久久久久| 日本黄大片高清| 亚洲国产精品sss在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 久久草成人影院| av在线老鸭窝| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲成av人片在线播放无| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久热精品热| 亚洲av.av天堂| 国产精品女同一区二区软件 | 一区二区三区四区激情视频 | 90打野战视频偷拍视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 在线观看午夜福利视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 嫩草影院新地址| a在线观看视频网站| 中出人妻视频一区二区| 国产探花在线观看一区二区| 国产黄片美女视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 嫩草影视91久久| 久久亚洲精品不卡| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美中文日本在线观看视频| 精品日产1卡2卡| 色综合婷婷激情| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产真实伦视频高清在线观看 | av天堂在线播放| 丰满的人妻完整版| av在线天堂中文字幕| 色精品久久人妻99蜜桃| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美黄色淫秽网站| av专区在线播放| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 此物有八面人人有两片| 五月玫瑰六月丁香| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产av麻豆久久久久久久| 看十八女毛片水多多多| 亚洲片人在线观看| 国产精品久久视频播放| 久久草成人影院| 久久久久久久久中文| 久久精品人妻少妇| 亚洲综合色惰| 亚洲av电影在线进入| 亚洲国产色片| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 1000部很黄的大片| 国产精品一及| 久久久久国内视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 色5月婷婷丁香| 亚洲精品亚洲一区二区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久国产成人精品二区| av专区在线播放| 国产视频一区二区在线看| 午夜福利18| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美黄色淫秽网站| 麻豆一二三区av精品| 亚洲中文字幕日韩| 久久精品国产清高在天天线| av视频在线观看入口| 91麻豆av在线| 一本综合久久免费| 男人舔奶头视频| 欧美精品国产亚洲| 一个人观看的视频www高清免费观看| 首页视频小说图片口味搜索| 一本综合久久免费| 好男人电影高清在线观看| 免费av毛片视频| 超碰av人人做人人爽久久| 日本黄色片子视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 欧美三级亚洲精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 90打野战视频偷拍视频| 午夜免费激情av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲av中文字字幕乱码综合| 两个人的视频大全免费| 美女黄网站色视频| 色播亚洲综合网| 日韩有码中文字幕| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 午夜福利高清视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲国产色片| 日韩大尺度精品在线看网址| 悠悠久久av| 精品乱码久久久久久99久播| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产av一区在线观看免费| 国内精品一区二区在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 三级毛片av免费| 亚洲无线观看免费| 97碰自拍视频| 制服丝袜大香蕉在线| 国内精品久久久久久久电影| 99热精品在线国产| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲,欧美精品.| 亚洲成av人片免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲精品色激情综合| 禁无遮挡网站| 亚洲av成人精品一区久久| 1000部很黄的大片| 男女床上黄色一级片免费看| 日日干狠狠操夜夜爽| 成熟少妇高潮喷水视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 免费大片18禁| 精品久久久久久成人av| 免费av不卡在线播放| 一a级毛片在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品国产高清国产av| 一进一出好大好爽视频| 在现免费观看毛片| 精品一区二区三区av网在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 精品久久久久久久久av| 国产中年淑女户外野战色| 欧美日本视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久6这里有精品| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久99热这里只有精品18| 免费大片18禁| 亚洲最大成人av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 窝窝影院91人妻| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产视频内射| 成年版毛片免费区| 久久亚洲精品不卡| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜a级毛片| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲欧美激情综合另类| 看片在线看免费视频| 在线观看av片永久免费下载| 日韩欧美三级三区| 男人的好看免费观看在线视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 最好的美女福利视频网| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲不卡免费看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 丝袜美腿在线中文| 中文字幕久久专区| 五月伊人婷婷丁香| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲精品在线美女| 成年女人永久免费观看视频| 成人亚洲精品av一区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩av在线大香蕉| 久久久久久久久中文| 高清日韩中文字幕在线| 美女cb高潮喷水在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美午夜高清在线| 午夜精品在线福利| 久久久久久久久久成人| 精品国产三级普通话版| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产久久久一区二区三区| 欧美区成人在线视频| 国产黄a三级三级三级人| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美+亚洲+日韩+国产| а√天堂www在线а√下载| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩免费av在线播放| 一个人免费在线观看电影| 色av中文字幕| 三级国产精品欧美在线观看| 日本免费a在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 超碰av人人做人人爽久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av二区三区四区| 日韩欧美三级三区| 久久99热6这里只有精品| 国产老妇女一区| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 少妇的逼好多水| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产极品精品免费视频能看的| 免费大片18禁| 国产在视频线在精品| 国产野战对白在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲中文日韩欧美视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| netflix在线观看网站| 国产私拍福利视频在线观看| bbb黄色大片| 在线观看免费视频日本深夜| 久久久精品欧美日韩精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产一区二区在线av高清观看| 成人鲁丝片一二三区免费| av天堂中文字幕网| 亚洲无线在线观看| 久久久久性生活片| 又紧又爽又黄一区二区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 精品久久久久久久久亚洲 | 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产亚洲精品av在线| 亚洲av.av天堂| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美三级亚洲精品| 制服丝袜大香蕉在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 麻豆国产av国片精品| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 免费看日本二区| 午夜福利高清视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 18+在线观看网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品久久久久久成人av| 精品人妻1区二区| 麻豆国产av国片精品| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久久亚洲av毛片大全| 天天躁日日操中文字幕| 色5月婷婷丁香| 九色成人免费人妻av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜福利18| 真人一进一出gif抽搐免费| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久精品欧美日韩精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 日韩中字成人| 午夜激情福利司机影院| 国产午夜福利久久久久久| 夜夜爽天天搞| 亚洲成av人片在线播放无| 国产av不卡久久| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 看免费av毛片| 亚洲综合色惰| 欧美成人免费av一区二区三区| 日本与韩国留学比较| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久热精品热| 一级作爱视频免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 哪里可以看免费的av片| 免费黄网站久久成人精品 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| or卡值多少钱| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产高清视频在线观看网站| 精品久久久久久成人av| 成人三级黄色视频| 国内精品久久久久久久电影| 1000部很黄的大片| 男插女下体视频免费在线播放| 老司机深夜福利视频在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲国产精品999在线| 一进一出抽搐动态| 亚洲成人久久性| 成人无遮挡网站| 搞女人的毛片| 极品教师在线免费播放| 18+在线观看网站| 精品久久国产蜜桃| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲激情在线av| 亚洲第一电影网av| eeuss影院久久| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲 国产 在线| 日韩有码中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲经典国产精华液单 | 中文字幕高清在线视频| 天堂√8在线中文| 天堂网av新在线| 天堂动漫精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 在线免费观看的www视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| av国产免费在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲精品在线观看二区| 国产美女午夜福利| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久久久久九九精品二区国产| 一本一本综合久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 嫩草影院入口| 看十八女毛片水多多多| 一个人免费在线观看电影| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 69人妻影院| 搞女人的毛片| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产午夜精品论理片| 乱人视频在线观看| 在线国产一区二区在线| 极品教师在线免费播放| 欧美日本视频| 制服丝袜大香蕉在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 我要搜黄色片| 国产免费男女视频| 观看美女的网站| 日韩精品中文字幕看吧| 性插视频无遮挡在线免费观看| .国产精品久久| 欧美成人性av电影在线观看| 国产毛片a区久久久久| 久久久久久久精品吃奶| 国产乱人伦免费视频| 欧美黑人巨大hd| 看十八女毛片水多多多| 欧美在线一区亚洲| 波野结衣二区三区在线| 18美女黄网站色大片免费观看| 婷婷精品国产亚洲av| 国模一区二区三区四区视频| 黄色日韩在线| 国产精华一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美又色又爽又黄视频| 能在线免费观看的黄片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 免费在线观看成人毛片| 深夜a级毛片| 亚洲人成网站在线播| 草草在线视频免费看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 午夜精品在线福利| 国内精品美女久久久久久| 成人性生交大片免费视频hd| 成人国产一区最新在线观看| 久久99热6这里只有精品| av国产免费在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久亚洲精品不卡| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 有码 亚洲区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看|